氢溴酸樟柳碱对离体大鼠颈总动脉的作用及机制研究

潘媛， 彭成， 江虹雨， 岳美颖， 唐光梅， 谢晓芳

(成都中医药大学药学院，成都610075)

樟柳碱是从唐古特东莨菪碱植物中提取的一种抗胆碱能药，药理作用广泛，以对神经系统的作用为主(彭建中，金丽容，1982)，其次有抗心肌缺血(陈锦明等，1983)、抗肺急性损伤(王火等，1999)、抗肾损伤(吴广礼等，2002)、抗胃溃疡(张建福等，1990)、抗组胺受体(詹皓等，1987)等作用。在临床上，氢溴酸樟柳碱可用于偏头痛、血管性头痛等，且早在1975年就有用于偏头痛的临床报道(四川医学院附院神经科，徐州医学院附院神经科，1975)。依据偏头痛的血管源学说，认为颅内动脉收缩引起先兆，然后颅外血管扩张，血管周围组织产生血管活性物质导致无菌性炎症而诱发头痛。但氢溴酸樟柳碱对血管的作用尚不清楚。本实验研究氢溴酸樟柳碱对离体血管环的作用，拟初步明确氢溴酸樟柳碱对血管收缩舒张功能的影响。

1 实验材料

1.1 药品与试剂

氢溴酸樟柳碱(高效液相色谱纯度>98.5%)原料药由成都第一制药提供，生产批号：14120，临用前精密称取氢溴酸樟柳碱0.301 8 g用超纯水溶解至1.5 mL，配置成0.5 mol·L-1的氢溴酸樟柳碱母液；苯肾上腺素(phenylephrine，PHE；Sigma)，生产批号：1000957684；左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME；Sigma)，生产批号：10093568；乙酰胆碱(acetylcholine，Ach；Bomei)，生产批号：A0041；格列本脲(glyburide，Gly；Sigma)，生产批号：1001896356；4-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP；Sigma)，生产批号：1001809775；四乙基氯化铵(tetraethylammonium chloride，TEA；Sigma)，生产批号：1000940891。

1.2 实验动物

SPF级成年健康雌性或雄性SD大鼠，体质量180～220 g，购自四川省医学科学院实验动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2013-15，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2008-049。饲养温度21～27 ℃，湿度50%±5%，昼夜光照及通风环境自然调节。实验程序严格按照动物管理章程。

1.3 实验仪器

HH-4型数显电子恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，FA2004B型电子天平(上海越平科学仪器有限公司)，D2-8实验室纯水系统(成都宝塞思科技有限公司)，可调式移液器(Thermo Fisher Scientific)，低温冰箱(青岛海尔股份有限公司)，M870B5/10型离体组织灌流系统、ML870型PowerLab生物信号采集系统、MLT0201型张力换能器、LabchartPro均购自埃德仪器国际贸易(上海)有限公司。

2 实验方法

2.1 大鼠颈总动脉环的制备

用10%水合氯醛麻醉大鼠，然后快速取出其颈总动脉，并置于O2饱和且持续通入95%O2+5%CO2的4 ℃的K-H液(NaCl：118.4 mmol·L-1，KCl：4.7 mmol·L-1，CaCl2：2.5 mmol·L-1，KH2PO4：1.2 mmol·L-1，MgSO4：1.2 mmol·L-1，Na2HCO3：25.0 mmol·L-1，C6H12O6：10.1 mmol·L-1，乙二胺四乙酸：0.03 mmol·L-1；pH7.4)，剔除周围的结缔组织，剪成大约3 mm的血管环，并用2根针灸针制成的挂钩水平悬挂于浴管内，一端固定于浴管内，另一端连接张力换能器，并将前负荷调节为0.8 g，使用PowerLab生物信号采集系统采集和记录张力的变化。浴槽内含有K-H液，恒温37 ℃，持续不断通入95%O2+5%CO2，每15 min换一次预热到37 ℃的K-H液，共平衡60 min。此后，用90 mmol·L-1KCl连续刺激大鼠颈总动脉环连续2次，每次40 min，以诱发最大张力。刺激后，用预热到37 ℃的K-H液连续冲洗3次，每次5 min，待恢复到基础状态后，调节前负荷至0.8 g，再稳定30～60 min。当连续相同刺激所引起的颈总动脉环血管收缩幅度差小于10%时，认为血管稳定，可以开始实验(胡冠英，2015)。

2.2 血管环去内皮检测

将削好的牙签穿过制备好的血管环内腔，轻轻旋转，以机械力去除其内皮。再用1 μmol·L-1PHE收缩血管环，待收缩张力达到坪值(即张力不再上升)后，往槽内加入10 μmol·L-1Ach舒张血管环，若舒张幅度大于80%，则认为内皮完整；若舒张幅度小于10%，则认为去内皮成功。

2.3 氢溴酸樟柳碱对KCl预收缩血管环的影响

将符合实验条件的血管环随机分为KCl预收缩对照组(n=8)、KCl预收缩加氢溴酸樟柳碱组(n=8)。血管环稳定后，往浴槽内加入90 mmol·L-1KCl预收缩，当血管环收缩张力达到坪值时(约40 min)，向浴槽内累积加入氢溴酸樟柳碱(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或对照剂(K-H液)，建立氢溴酸樟柳碱浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较不同浓度氢溴酸樟柳碱对90 mmol·L-1KCl预收缩血管环的舒张作用。以90 mmol·L-1KCl所致的血管环最大收缩张力为100%，计算各浓度下氢溴酸樟柳碱所致的舒张百分比。

2.4 氢溴酸樟柳碱对PHE预收缩血管环的影响

将符合实验条件的血管环随机分为PHE预收缩对照组(n=8)、PHE预收缩加氢溴酸樟柳碱组(n=8)。血管环稳定后，往浴槽内加入1 μmol·L-1PHE预收缩，当血管环的收缩张力达到坪值时(约20 min)，向浴槽内累积加入氢溴酸樟柳碱(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或对照剂(K-H液)，建立氢溴酸樟柳碱浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较不同浓度氢溴酸樟柳碱对1 μmol·L-1PHE预收缩血管环的舒张作用。以1 μmol·L-1PHE所致的血管环最大收缩张力为100%，计算各浓度下氢溴酸樟柳碱所致的舒张百分比。

2.5 氢溴酸樟柳碱对PHE预收缩内皮完整和去内皮的血管环的影响

将符合实验条件的血管环随机分为PHE预收缩加氢溴酸樟柳碱组(n=8)、去内皮组(n=8)。取去内皮的血管环，待血管环稳定后，向浴槽内加入1 μmol·L-1PHE预收缩，当血管环收缩张力达到坪值时(约20 min)，向浴槽内累积加入氢溴酸樟柳碱(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氢溴酸樟柳碱的浓度依赖舒张效应曲线，观察和比较不同浓度下氢溴酸樟柳碱对1 μmol·L-1PHE预收缩内皮完整和去内皮的血管环的舒张作用。分别以1 μmol·L-1PHE对内皮完整或去内皮的血管环所致的最大收缩张力为100%，分别计算各浓度氢溴酸樟柳碱所致的舒张百分比。

2.6 氢溴酸樟柳碱对L-NAME预孵血管环的影响

将符合实验条件的血管环随机分为PHE预收缩加氢溴酸樟柳碱组(n=8)、L-NAME预孵组(n=8)。血管环稳定后，向浴槽内加入1 μmol·L-1PHE预收缩，当血管环收缩张力达到坪值时(约20 min)，再加入1×10-4mol·L-1L-NAME预孵20 min，向浴槽内累积加入氢溴酸樟柳碱(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氢溴酸樟柳碱浓度依赖舒张效应曲线，在1 μmol·L-1PHE预收缩的基础上，观察和比较各浓度氢溴酸樟柳碱对L-NAME预孵血管环的舒张作用。以1 μmol·L-1PHE对血管环所致的最大收缩张力为100%，计算各浓度氢溴酸樟柳碱对L-NAME预孵血管环所致的舒张百分比。

2.7 氢溴酸樟柳碱对钾离子通道阻滞剂预孵血管环的影响

将符合实验条件的血管环随机分为PHE预收缩加氢溴酸樟柳碱组(n=8)、TEA预孵组(n=8)、4-AP预孵组(n=8)、Gly预孵组(n=8)、BaCl2预孵组(n=8)。血管环稳定后，向浴槽内加入1 μmol·L-1PHE预收缩，当血管环收缩张力达到坪值时(约20 min)，再分别加入钾离子通道阻滞剂(1×10-2mol·L-1TEA、1×10-3mol·L-14-AP、1×10-5mol·L-1Gly或1×10-4mol·L-1BaCl2)预孵20 min，向浴槽内累积加入氢溴酸樟柳碱(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氢溴酸樟柳碱的浓度依赖舒张效应曲线，在1 μmol·L-1PHE预收缩血管环的基础上，观察和比较各浓度氢溴酸樟柳碱对各种钾离子通道阻滞剂预孵血管环的舒张作用。以1 μmol·L-1PHE对血管环所致的最大收缩张力为100%，计算各浓度氢溴酸樟柳碱对钾离子通道阻滞剂预孵血管环所致的舒张百分比。

2.8 氢溴酸樟柳碱对血管环外Ca2+内流和内Ca2+释放的影响

血管环稳定后，观察氢溴酸樟柳碱对其外Ca2+内流和内Ca2+释放的影响。为保证平滑肌细胞内Ca2+充足，用100 mmol·L-1KCl收缩血管环。待张力到达坪值后，用无Ca2+溶液连续冲洗3次，每次5 min，并用无Ca2+溶液平衡30 min后，浴槽内加入氢溴酸樟柳碱2×10-3mol·L-1预孵血管环20 min，再加入1 μmol·L-1PHE，血管环呈现短暂收缩。收缩张力达到坪值后，继续加入3 mmol·L-1CaCl2，血管环再次出现收缩并达到峰值，分别观察在无钙溶液中氢溴酸樟柳碱预孵对PHE或CaCl2所致血管环收缩的抑制作用。

2.9 数据统计

3 结果

3.1 氢溴酸樟柳碱对KCl预收缩血管环的影响

氢溴酸樟柳碱可浓度依赖地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒张KCl预收缩血管环，结果显示，Emax=33.97%±11.53%，并在低浓度(1×10-4～1×10-3mol·L-1)下有收缩血管的作用(P<0.01，P<0.05)(图1)。

3.2 氢溴酸樟柳碱对PHE预收缩血管环的影响

氢溴酸樟柳碱可浓度依赖地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒张PHE预收缩血管环，结果显示，与对照组之间的差异有统计学意义(P<0.05)，EC50=5.61(3.88， 8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%(图2)。

图1 氢溴酸樟柳碱对KCl预收缩血管环张力的影响Fig. 1 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of KCl precontracted vascular ring (n=8，

*P<0.05，**P<0.01； 下同， the same below

图2 氢溴酸樟柳碱对苯肾上腺素预收缩血管环张力的影响Fig. 2 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring (n=8，

3.3 氢溴酸樟柳碱对PHE预收缩内皮完整和去内皮血管环的影响

氢溴酸樟柳碱可浓度依赖性地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒张PHE预收缩内皮完整和去内皮的血管环，结果显示，内皮完整血管环的EC50=5.61(3.88，8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%；去内皮血管环的EC50=5.64(4.42， 7.20) mmol·L-1，Emax=46.72%±8.97%，与内皮完整血管环的相比，舒张率无明显变化(P>0.05)(图3)。

图3 氢溴酸樟柳碱对苯肾上腺素预收缩的内皮完整(E+)和去内皮(E-)血管环张力的影响Fig. 3 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring with (E+) and without (E-) endothelium (n=8，

3.4 氢溴酸樟柳碱对L-NAME预孵血管环的影响

氢溴酸樟柳碱可浓度依赖地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒张L-NAME预孵血管环，结果显示， Emax=42.44%±16.47%。用L-NAME预孵血管环后，氢溴酸樟柳碱对血管的舒张效果无明显减弱(P>0.05)(图4)。

图4 氢溴酸樟柳碱对左旋硝基精氨酸甲酯预孵血管环张力的影响Fig. 4 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of Nω-nitro-L-arginine methyl ester precontracted

3.5 氢溴酸樟柳碱对钾离子通道阻滞剂预孵血管环的影响

TEA、4-AP、Gly、BaCl2对氢溴酸樟柳碱舒张PHE预收缩血管环均无明显作用，Emax分别为91.07%±19.94%(P>0.05)、45.60%±22.88%(P>0.05)、41.11%±8.69%(P>0.05)、41.52%±14.39%(P>0.05)(图5)。

3.6 氢溴酸樟柳碱对血管环外Ca2+内流和内Ca2+释放的影响

在无Ca2+溶液中，2×10-3mol·L-1氢溴酸樟柳碱可以显著增强PHE引起的血管短暂收缩，Emax由7.57%±5.99%增加至17.13%±5.58%(P<0.01)，增加了9.56%±9.09%。在此基础上，加入CaCl2，血管环再次出现收缩，经氢溴酸樟柳碱预孵的血管环与对照组的收缩率分别为33.13%±6.77%、38.37%±13.24%，二者差异无统计学意义。

4 讨论

细胞外流入和细胞内Ca2+释放是血管平滑肌收缩所需Ca2+的主要来源，包括经受体操作性钙通道(receptor operated calcium channel，ROC)和电压依赖性钙通道(voltage dependent calcium channel，VDC)的外钙流入及主要来自肌浆网的内钙释放(Hamadaetal.，1997；Carmignotoetal.，1998)。KCl诱导的血管收缩是通过细胞膜去极化激活VDC，而PHE则是与α1受体特异性结合激活ROC，外钙内流从而引起血管收缩(Kravtsov & Kwan，1995；Ratz & Berq，2006)。氢溴酸樟柳碱在体外1×10-4～5×10-3mol·L-1范围内能浓度依赖性舒张KCl和PHE诱导的颈总动脉环收缩，表明氢溴酸樟柳碱舒张血管与抑制ROC和VDC介导的外Ca2+内流有关，氢溴酸樟柳碱对PHE预收缩的血管舒张作用强于KCl，且对KCl预收缩血管的作用具有低浓度收缩血管、高浓度舒张血管的双向作用，这有待进一步探索。

将离体大鼠颈总动脉环去除内皮，或以L-NAME、KCa通道阻滞剂TEA、KV通道阻滞剂4-AP、KIR通道阻滞剂BaCl2和KATP通道抑制剂Gly预孵血管环，均对氢溴酸樟柳碱的舒张血管作用无显著抑制作用，表明氢溴酸樟柳碱通过非内皮依赖途径舒张血管，且与NO及Kv、KCa、KIR、KATP通道无关。而在无钙溶液中的结果提示，氢溴酸樟柳碱促进血管收缩的机制可能与促进肌浆网内Ca2+的释放有关。对于PHE预收缩的去内皮血管环，Emax无明显变化，表明氢溴酸樟柳碱通过非内皮依赖途径舒张血管。L-NAME不能抑制氢溴酸樟柳碱对PHE诱导的血管环收缩的舒张作用，表明NO没有介导氢溴酸樟柳碱对血管环的舒张作用。钾离子通道在维持血管张力方面有着重要的作用。本研究在KCl诱导的颈总动脉环收缩的基础上，分别用TEA、4-AP、BaCl2和Gly预敷血管环，发现均对氢溴酸樟柳碱的血管舒张反应无显著抑制作用，表明氢溴酸樟柳碱的血管舒张作用与Kv、KCa、KIR、KATP通道无关。氢溴酸樟柳碱对血管环外Ca2+内流和内Ca2+释放的影响结果显示，其促进血管收缩的机制可能与促进肌浆网内Ca2+的释放有关。

氢溴酸樟柳碱是一种抗胆碱能药，具有广泛的药理活性。在中枢神经系统方面，氢溴酸樟柳碱可改善双侧颈总动脉结扎所致慢性脑缺血大鼠的氧化应激状态，减少神经细胞损伤与凋亡，且其机制与减少P53蛋白表达有关(陈丹丹等，2018)；氢溴酸樟柳碱还可对抗线栓法所致的大鼠大脑中动脉阻塞脑缺血/再灌注损伤，降低模型动物病理学评分，提高存活神经元数目，其机制与抗氧化损伤及提高p-Akt的表达有关(陈丹丹等，2017b)；在体外用氯化钴处理肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，建立化学性缺氧模型，氢溴酸樟柳碱干预后可显著提高细胞存活率，较好恢复细胞形态，其机制与诱导低氧状态细胞自噬有关(陈丹丹等，2017a)；氢溴酸樟柳碱还可调节正常大鼠脑组织内单胺类神经递质代谢(匡培根等，1984)。除对中枢神经系统的作用外，氢溴酸樟柳碱也可改善血流变及微循环。氢溴酸樟柳碱可改善坏死性胰腺炎模型犬的血液流变性(严律南等，1990)，改善急性肾功能衰竭大鼠的肾动脉血管功能，保护肾微血管损伤(吴广礼等，2002)，扩张大鼠肠系膜微动脉管径(刘萍等，1999)。氢溴酸樟柳碱与普鲁卡因的复方制剂——复方樟柳碱被广泛应用于眼科，可改善眼缺血和保护视神经，在临床上可用于治疗视网膜病变、缺血性视神经及脉络膜病变等(彭娟等，2007)。

氢溴酸樟柳碱的药理作用虽然广泛，但关于其对血管作用的研究却鲜有报道。本实验研究氢溴酸樟柳碱对离体大鼠颈总动脉环的作用，初步明确氢溴酸樟柳碱能够浓度依赖性地舒张大鼠颈总动脉环，且对KCl预收缩的大鼠颈总动脉血管环具有小剂量收缩、大剂量舒张的双向作用，与其对血管具有双向作用的相关实验报道(陈锦明等，1983)相符。本课题组在后续还将继续就氢溴酸樟柳碱对微循环的影响做进一步研究。

综上所述，氢溴酸樟柳碱能够浓度依赖性地舒张大鼠颈总动脉环，且其机制与非内皮依赖途径及促肌浆网内钙释放相关。