细胞微丝骨架在玉米抗纹枯病菌Rhizoctonia solani侵染中的作用

王伟 裴艳刚 王宇霜 孙霞 戴浩 龚国淑 常小丽

摘要

为探究细胞微丝骨架在玉米抗纹枯病侵染过程中的作用，采用微丝骨架解聚剂LatB预处理玉米离体叶片后接种立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG1-IA，显微观察病原菌的侵染过程，并检测活性氧（ROS）、细胞坏死及抗病基因（PR1、ZmDREB2A）表达等抗病反应情况。结果显示，与未经LatB预处理相比，LatB预处理加快了R.solani侵染后玉米病斑的形成，并影响了侵染结构的发育;在侵染后期，LatB促进了R.solani诱导的玉米叶片中ROS积累、细胞坏死反应和PR1基因表达;溶剂DMSO预处理与未经LatB预处理的结果类似，表明DMSO对本试验的影响较小。研究表明，细胞微丝骨架不仅参与玉米抗R.solani的侵入，而且通过调控ROS、PR1基因表达，细胞死亡等抗病信号提高玉米抗病防御能力。本研究为进一步研究细胞微丝骨架在玉米对纹枯病的抗病机理中的作用提供了重要参考。

关键词

玉米; 立枯丝核菌; 细胞微丝骨架; 活性氧; 抗病基因

中图分类号：

S 435.4

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2016252

Roles of actin filaments in defense against Rhizoctonia solani

causing banded leaf and sheath blight of maize

WANG Wei， PEI Yangang， WANG Yushuang， SUN Xia， DAI Hao， GONG Guoshu， CHANG Xiaoli

（College of Agriculture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract

In order to find out the role of cellular actin filaments in maize resistance to Rhizoctonia solani causing banded leaf and sheath blight， detached maize leaves were pretreated with the actin filament depolarization， latrunculin B （LatB）， before inoculation with R.solani AG1-IA， and then collected at different time points in this study. Disease development and pathogen infectious structures were observed through the microscope， and meanwhile， defense responses including ROS accumulation， cell death and defense gene expression （PR1 and ZmDREB2A） were also examined. The results showed that， compared to inoculation with R.solani alone， pretreatment with LatB led to an earlier disease lesions and development of infectious structures. Additionally， ROS accumulation， cell death and defense gene expression were much higher than that without LatB pretreatment. In addition， pretreatment with the solvent DMSO showed similar results to the control without LatB treatment， indicating that DMSO had little effect on the LatB treatment. These data demonstrated that cellular cytoskeletal actin filaments not only functioned on pathogen invasion， but also regulated ROS accumulation， PR1 expression and cell death， all of which worked together to suppress pathogen spread on maize leaves and enhance maize resistance. This study provides important information for further studies on the role of actin filaments in maize resistance.

Key words

maize; Rhizoctonia solani; cellular actin filaments; ROS; defense-related gene

玉米Zea mays L.是世界三大谷類作物之一，既作为主要的食、饲兼用作物，也是重要的工业及能源原料，对国家的粮食安全起着举足轻重的作用[1]。玉米纹枯病（banded leaf and sheath blight，BLSB）是国内外玉米产区广泛发生、且危害严重的土传病害之一[2]。在我国，玉米纹枯病菌以立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn融合菌群AG1-IA为优势病原菌，其具有土传性、寄主范围广、适应性强和高致病性等特点[3-4]。近年来，由于我国高投入、单一化大面积的玉米种植模式，导致玉米纹枯病发生日趋严重，成为我国各玉米产区的主要病害之一[1]，严重影响玉米产量。选育和利用抗病玉米品种是防治玉米纹枯病最经济、有效的途径[2]，然而，国内外关于玉米抗纹枯病机制有待深入研究。细胞微丝骨架（actin filaments）是植物细胞骨架的重要组成结构，其在生物体内行使多种生理功能，同时也参与植物抗病防御过程[5-6]。研究表明，细胞微丝骨架的动态变化参与了病原菌侵染点细胞壁乳突形成相关物质的运输[6]、保卫细胞中K+离子通道的开闭[7]、NO诱导的气孔关闭[8]、活性氧积累（ROS）、细胞坏死反应及抗病相关基因的表达等抗病防御相关反应[6]。目前，关于细胞微丝骨架在玉米抗纹枯病侵染过程中的作用机制研究较少。

本研究通过细胞微丝骨架解聚剂LatB预处理后接种玉米纹枯病致病菌立枯丝核菌R.solani AG1-IA，观察玉米叶片病斑扩展及R.solani侵染结构发育情况，检测叶片中活性氧（ROS）积累、细胞坏死及抗病基因（PR1、ZmDREB2A）表达等抗病防御反应情况，旨在初步探明细胞微丝骨架在玉米对纹枯病抗病过程中的作用，为玉米抗病育种及纹枯病防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试品种及菌株

供试玉米品种为‘登海605，购自山东登海种业股份有限公司，为常规品种，经抗性鉴定对纹枯病表现为中抗;立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn融合群菌株AG1-IA由四川农业大学植物病理系实验室提供。

1.2 试剂及仪器

主要试剂：微丝骨架解聚剂latrunculin B （LatB），购自Sigma-Aldrich公司;反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser购自宝生物工程（大连）有限公司;TRIzol总RNA提取试剂盒、Taq PCR Master Mix、DNA Marker、核酸染料等均购自天根生化科技有限公司;二氨基联苯胺DAB（3，3-diaminobenzidine）、台盼蓝（Trypan Blue）、DMSO（二甲基亚砜）、琼脂糖、考马斯亮蓝、甲醇、三氯乙醇、甘油及其余常规试剂购自成都博大泰克生物公司。引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

主要仪器：5424R型台式高速冷冻离心机、Universal Hood II凝胶成像仪、C1000 PCR扩增仪，购自美国Bio-Rad公司;Nanodrop 2 000超微量分光光度计，购自美国Thermo Scientific公司;DYY-6C型凝胶电泳仪，购自北京六一仪器厂;Nikon Eclipse 80i显微镜购自日本Nikon公司;GXM型智能光照培养箱，购自宁波江南仪器厂，以上仪器均由四川农业大学植物病理实验室提供。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米盆栽苗培育

将玉米种子用75%乙醇处理1 min，然后用0.1%的次氯酸钠处理20 s，蒸馏水冲洗3～5 次，将消毒好的玉米种子置于培养皿中经无菌水浸润灭菌滤纸上，于生长温度22～28℃、相对湿度75%的恒温箱中培养催芽，1 d后取出移栽于装有灭菌基质土的直径10 cm的花盆中，当玉米长至5～6片叶时进行接种处理。

1.3.2 病原菌活化及接种

将AG1-IA菌株接入马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基（PDA，马铃薯200 g，葡萄糖10 g，琼脂10 g，水1 000 mL），置于25～28℃恒温下扩大培养3 d，至长满整个培养皿待用。

将玉米叶片剪成长4 cm、宽2 cm的叶段，置于垫有灭菌滤纸的培养皿中保湿。参照Henty-Ridilla等[9]的使用濃度，将微丝骨架解聚剂latrunculin B（LatB）先用DMSO（二甲基亚砜）配制成2 mol/L的母液，再用蒸馏水稀释至2 mmol/L作为工作浓度，以确保DMSO浓度小于0.1%，不影响LatB的作用效果。采用无针头注射器将20 μL LatB （2 mmol/L）注入玉米叶肉细胞中，30 min后接种AG1-IA菌饼于注射部位作为处理样品，以注射等体积DMSO和灭菌蒸馏水后接种AG1-IA的叶片为对照，每个处理重复3次，试验进行3次。接种后置于25℃保湿培养过夜，并于接种后不同时间点（0、6、12、24、48 h和72 h）收集材料，用于病原菌侵染结构观察及抗病相关反应检测。

1.3.3 玉米纹枯病菌侵染结构的观察

于接种后不同时间点（0、6、12、24、48 h和72 h）取接种叶段材料，用脱色液（无水乙醇∶甘油∶无菌水，体积比为15∶1∶4）沸水浴脱色1 h至透明，然后用考马斯亮蓝染色液（0.15%三氯乙酸水溶液∶0.6%考马斯亮蓝R-250甲醇溶液，体积比1∶1）染色10 min，最后用自来水漂洗3～5次至染液洗净。制片，并在显微镜（Nikon Eclipse 80i）下观察病原菌侵染结构发育。

1.3.4 活性氧测定

活性氧（ROS）的检测采用二氨基联苯胺DAB（3，3-diaminobenzidine）染色法 [10]。取接种后不同时间段的玉米叶片，蒸馏水洗净后置于15 mL离心管中，加入适量DAB染液（1 mg/mL，pH 5.8）至完全浸没叶片，用真空抽滤泵抽滤5 min 后置于28℃避光保存8 h，随后取出离心管光照1 h至红棕色斑点显现。弃掉各管染液，用无菌水漂洗3次洗去浮色，加入脱色液（无水乙醇∶甘油∶水，体积比15∶1∶4），沸水浴直至叶片绿色完全褪去，重复1次，重新加入脱色液，置于4℃冰箱内保存。拍照后，采用Image J软件统计染色面积占总叶片面积的百分比，并在显微镜下观察细胞ROS产生情况。

1.3.5 细胞坏死观察

叶片细胞坏死采用台盼蓝染色法[10]进行检测。取接种后不同时间段的玉米叶片，蒸馏水洗净后置于培养皿中，加入适量台盼蓝染液（乳酸∶水饱和酚∶甘油∶1 mg/mL台盼蓝，体积比1∶1∶1∶1）至完全浸没叶片，28℃下放置4 h。随后取出叶片， 用无菌水漂洗3次，洗去浮色后放入15 mL离心管中，加入脱色液（无水乙醇∶甘油∶水，体积比15∶1∶4），并沸水浴直至叶片绿色完全褪去，弃掉各管液体重新加入脱色液，置于4℃冰箱内保存并拍照记录，计算染色面积占叶片总面积的百分比，用以评价细胞坏死情况。

1.3.6 抗病相关基因表达检测

在接种后0、6、12、24、48和72 h后分别取处理叶片200 mg，无菌水洗净，灭菌纸擦干后加入液氮进行研磨，参照TRIzol试剂盒操作手册提取总RNA。用NanoDrop 2 000超微量分光光度计检测RNA的质量。采用反转录试剂盒获得cDNA，反应体系包括：1 μL Oligo dT18 Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL Fracs Script RT/RI Enzyme Mix、gRNA Remover，用RNase-free Water补足至20 μL，反应条件为：42℃，30 min;85℃，5 min;4℃，保存。反转录获得的cDNA用ddH2O按1∶20（V/V）稀释后待用。PCR扩增体系为：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix、9.5 μL 灭菌ddH2O、1 μL Primer F、1 μL Primer R、1 μL cDNA。引物序列分别为：18S rRNA （F： 5′-TCCTGAGTAACGAACGAGACC-3′和R：5′-CACGATGAAATTTCCCAAGAT-3′）[8]，PR1 （F：5′-AGGCTCGCGTGCCTCCTAGCTCTGG-3′和R： 5′-GGAGTCGCGCCACACACCTGCGTG-3′）[8]，ZmDREB2A （F： 5′-GTATCTTGATGAGCTGGGATTCGAG-3′和R：5′-GTGAAGCAAACCCAGTTCCC-3′）[11]。扩增条件为：94℃ 变性5 min;94℃变性30 s，58℃ 退火20 s，72℃延伸20 s，循环40次，72℃延伸5 min，4℃保持。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并采用凝胶成像仪进行拍照。

1.3.7 统计分析

用SPSS 22.0进行数据分析，采用t测验对经两种不同接种处理的玉米叶片中ROS、细胞坏死反应、菌丝体量进行差异显著性分析，显著水平为5%，并使用Excel 2010软件制图。

2 结果与分析

2.1 LatB预处理对玉米叶片发病情况的影响

采用R.solani AG1-IA接种玉米离体叶片后观察病斑扩展情况。结果如图1所示，在接种后0～6 h，LatB预处理、DMSO溶剂处理以及未经预处理的玉米叶片均未出现病斑。LatB预处理30 min后接种的玉米叶片在接种菌后12 h开始出现水渍状小病斑，且病斑处褪绿变黄;24～48 h时，病斑扩大且出现明显坏死;72 h时，叶片上出现典型的纹枯病危害后的云纹状坏死病斑。未预处理的玉米叶片在接种后24 h开始出现水渍状小病斑;接菌后48 h时，出现不同程度的、较多的病斑;随着病斑的扩展，72 h时玉米叶片均出现较为明显的纹枯病水渍状云纹病斑。与未预处理叶片相似，DMSO预处理后接种的玉米叶片在24 h开始出现零星水渍状褪绿变黄斑，到48 h后病斑面积开始快速扩散，到72 h时叶片表面均匀出现云纹状纹枯病典型症状。结果表明LatB预处理加快了玉米离体叶片上病斑的出现，加速了玉米对R.solani的抗性反应。

2.2 LatB预处理对纹枯病菌侵染结构的影响

采用考马斯亮蓝对接种后不同时间点病原菌侵染结构进行染色，结果如图2所示。未经LatB预处理的叶片（图2，1a～1f），在接种后6 h时，菌丝伸长，并出现初级分枝（图2，1a）;接种12 h时，在初级分枝上出现许多短粗状的侧枝（图2，1b）;随后的24～48 h，侧枝顶端膨大形成裂瓣状的附着胞（图2，1c），且附着胞下形成侵染钉可直接侵入寄主表皮细胞（图2，1d），也可通过气孔侵入（图2，1e）;接种72 h时，大量侧枝及附着胞相互聚集在一起（图2，1f）。溶剂DMSO预处理后接种病菌结果显示，菌丝在接种后6 h不断伸长（图2，2a）;12 h时菌丝产生初级分枝，并且从气孔侵入玉米叶片（图2，2b）;接种24 h时，菌丝侧枝顶端开始形成瓣状附着胞（图2，2c）;接种48 h时，附着胞下产生侵入钉（图2，2e），菌丝变粗变短，分枝间距缩短（图2，2d）;接种72 h时，大量附着胞开始串生或簇生在一起，形成巨大的瓣状复合体（图2，2f）。经LatB预处理30 min后接种病原菌6 h时，菌丝顶端开始膨大（图2，3a）;12 h时，出现初级分枝，且初级分枝顶端膨大呈球形（图2，3b）;接种24 h时，初级分枝上出现马蹄型侵染垫，且能观察到侵入钉侵染玉米表皮细胞（图2，3c）;接种48 h，菌丝体继续分枝，大量马蹄形侵染垫形成（图2，3d），且在气孔处聚集大量菌丝体（图2，3e）;72 h时，垫状侵染结构及病原菌菌丝体均大量增加且聚集在一起（图2，3f）。结果表明LatB预处理对R.solani AG1-IA侵染结构在玉米叶片上的发育有影响，有利于病原菌的迅速入侵。

图1 不同接种处理后玉米叶片病斑扩展情况

Fig.1 Disease lesion development after inoculated by Rhizoctonia solani AG1-IA with or

without LatB pre-treatment on maize leaves

2.3 LatB预处理对接种后玉米叶片细胞内活性氧积累的影响

经LatB预处理，接种R.solani后不同时间点取玉米叶片用DAB染色，以DMSO预处理及未预处理作为对照，对ROS积累面积百分比进行统计，如图3所示，接种后6 ～12 h ROS开始积累，LatB预处理与未处理的叶片ROS积累量相当;接种后24 h，ROS积累量开始逐渐增加，经LatB预处理的叶片中ROS积累量显著高于未处理的叶片;接种后48 h，ROS积累量达到峰值，且经LatB预处理的叶片中的ROS积累量是未经LatB处理的2倍，随后接种72 h后ROS积累量有所降低。随着病原菌侵入，在24～72 h，在相同时间点经LatB预处理的叶片中ROS积累量始终显著高于未经LatB处理的叶片;其中，在使用溶剂DMSO处理后，在0～24 h时，活性氧的积累量都很低，当处理48 h后，活性氧的积累量显著快速增加，基本与未用LatB预处理的活性氧的积累量相同，但远低于经过LatB预处理组（图3）。结果表明细胞微丝骨架解聚剂LatB预处理可提高R.solani AG1-IA诱导的玉米叶片中ROS的积累量。

图2 不同预处理后Rhizoctonia solani AG1-IA侵染结构显微观察

Fig.2 Microscopy observation of Rhizoctonia solani AG1-IA infectious structure after different pretreatments on maize leaves

圖3 不同接种处理后玉米叶片活性氧产生面积百分比

Fig.3 ROS production in maize leaves after different

inoculation with Rhizoctonia solani AG1-IA

2.4 LatB预处理对接种后玉米叶片细胞坏死情况的影响

经LatB预处理，接种R.solani后不同时间点玉米叶片的细胞死亡情况采用台盼蓝染色法进行检测，以DMSO预处理及未预处理作为对照，统计叶片坏死斑面积百分比，结果如图4所示。在接种0 h时，各处理均无明显细胞死亡出现;接种后6～12 h，三种处理均有细胞死亡产生，未处理与DMSO预处理细胞死亡差异不显著，但LatB预处理的叶片细胞死亡面积显著增加;接种后24～48 h，未处理和DMSO预处理玉米叶片蓝色坏死斑开始大量出现，但在相同时间内其坏死斑面积较经LatB预处理略高;接种后72 h，各处理叶片经LatB预处理的叶片和未处理的叶片中细胞坏死面积相当。结果表明细胞微丝骨架解聚剂LatB处理后导致玉米叶片细胞微丝骨架解聚，在R.solani AG1-IA侵染前期，玉米叶片细胞大量死亡，以提高寄主的防御功能，减少自身受到损害。

2.5 LatB预处理对接种后玉米叶片抗病相关基因表达的影响

为了检测LatB预处理对病原菌R.solani AG1-IA接种后玉米叶片抗病相关基因的表达情况，本试验选择了病程相关蛋白PR1和玉米转录因子ZmDREB2A两个基因，以18S rRNA作为内参持家基因，采用半定量RT-PCR，在接种后不同时间点检测其表达水平，结果如图5所示：DMSO预处理、LatB预处理以及未经LatB预处理的玉米叶片中持家基因18S rRNA在接种后不同时间点的表达量基本相同，说明提取获得的玉米叶片总RNA稳定。在LatB预处理30 min后接种R.solani的玉米叶片中，PR1在接种12 h被诱导表达，24 h被抑制，随后48 h表达量最大，72 h表达量明显降低;而在未经LatB预处理的玉米叶片中，PR1在接种后48 h表达量显著增加，其他时间与0 h相比，变化不明显。ZmDREB2A基因在两种处理中的表达量在LatB预处理的玉米叶片中于接种后12 h有所升高，其他时间点变化不明显，而在未经LatB预处理的玉米叶片以及使用溶剂DMSO预处理的玉米叶片中各时间点均无特别显著变化。结果表明，细胞骨架解聚剂LatB预处理对转录因子ZmDREB2A的影响较小，但可强烈诱导水杨酸（SA）途径相关的PR1基因表达，可能与SA参与到玉米抗纹枯病防御机制有关。

图4 不同接种处理后玉米叶片细胞坏死情况

Fig.4 Necrotic cell areas of maize leaves after different

inoculation with Rhizoctonia solani AG1-IA

3 讨论

植物在与病原菌长期共进化互作过程中形成了一套十分复杂、精密的防御机制，细胞微丝骨架作为细胞骨架的重要组成结构，在植物抵御病原菌侵染过程时常发生解聚与聚合，在病原菌侵入及扩展过程中均发挥了重要作用[6，12]。本试验通过微丝骨架解聚剂预处理玉米叶片后接种纹枯病菌R.solani AG1-IA，对病原菌侵染结构发育情况及玉米抗病相关反应检测，初步明确了细胞微丝骨架在玉米抗纹枯病菌侵染中的作用。

图5 抗病基因的半定量RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

Fig.5 Representative agarose gels for semi-quantitative RT-PCR of defense gene expression

大量研究表明，细胞微丝骨架是植物抵御病原菌侵入的重要方式[12]。病原菌侵染后微丝骨架可在侵染点附近聚集，呈放射状排列，参与寄主细胞质内抗病相关物质及蛋白运输到病原菌侵染位点的过程[6]。Henty-Ridilla及其团队研究表明，受丁香假单胞杆菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000、农杆菌Agrobacterium tumefaciens和稻瘟病菌Magnaporthe grisea侵染1 h后均能观察到细胞微丝骨架聚集。采用细胞松弛素或者微丝骨架解聚剂LatB处理则病原菌成功侵染[9，14-15]。最近研究发现，细胞微丝骨架参与了大豆对病毒病的抗性，微丝骨架解聚有利于大豆花叶病毒病的发生[16]。本试验中，立枯丝核菌R.solani为兼性寄生菌，该菌常以侵染垫或裂片状附着胞侵染寄主，或者不产生专门的侵染结构，而由菌丝顶端直接穿透植物表面或从自然孔口（主要是气孔）及伤口侵入。本试验采用细胞微丝骨架解聚剂LatB处理离体玉米叶片30 min后接种R.solani，观察到病原菌菌丝分枝后迅速形成马蹄状侵染垫，并发育成侵入钉直接穿透表皮细胞完成侵入（图2，3c），在接种后6～12 h迅速出现病斑;而在未经LatB预处理的玉米叶片上，R.solani菌丝则出现较多侧枝后才形成短粗分瓣状的附着胞及侵入钉，或者延伸至气孔处进行侵入（图2，1c），在接种后24 h出现病斑（图4），表明细胞微丝骨架参与了寄主抵抗病原菌侵入的过程，LatB预处理导致微丝骨架解聚，破坏了依赖于微丝骨架的玉米叶片抗侵入结构，而有利于病原菌的菌丝快速发育成马蹄状侵染垫，其与多分支的裂瓣状附着胞相比能更迅速侵入寄主，并建立寄生关系。这一结果从Marshall等[17]的试验也得到证实，即纹枯病菌在水稻感病品种叶鞘表面形成大量的侵染垫，而抗病品种上则不形成侵染垫，只形成裂瓣状的附着胞。

已有研究发現，细胞微丝骨架不仅对侵染点附近原生质凝集和乳突积累有影响，还参与调控植物的抗病防御反应，如活性氧（ROS）积累、细胞死亡及抗病基因的表达[18-20]。采用微丝骨架解聚剂cytochalasin A处理后发现，白粉菌诱导的黄瓜叶片中过敏性细胞坏死、H2O2的产生及乳突的形成均明显受抑，表明微丝骨架解聚可促进小麦白粉菌的侵染[14，21]。采用细胞松弛素D处理，能够显著降低小麦-白粉菌互作[22]、小麦-叶锈病菌互作[23]、马铃薯-晚疫病菌互作[24]中寄主叶片细胞坏死的产生。与前人研究结果不同，本试验中，LatB预处理后接种病原菌，ROS在接种后24 h大量积累，推测可能与微丝骨架解聚能够诱导寄主抗病信号有关，从而抑制病原菌的扩展。此外，本试验还发现，LatB预处理提高R.solani 诱导的水杨酸抗病信号相关的PR1基因大量表达，表明在玉米纹枯病抗病反应中，细胞微丝骨架的作用与水杨酸途径有关，这一结果与Matouková等[25]的研究结果相似。

此外，本试验为排除溶剂DMSO对细胞微丝骨架解聚剂LatB效果的影响，补充设置了溶剂DMSO预处理对照，结果表明，DMSO预处理后接种R.solani 的玉米叶片上菌丝及其他侵染结构发育、叶片活性氧的积累量、细胞坏死以及抗病相关基因与未经LatB预处理组结果相似，表明溶剂DMSO在本次试验中对试验结果的影响可以忽略。

综上，本试验通过组织细胞染色法及抗病基因表达检测，初步明确了细胞微丝骨架可影响病原菌在玉米叶片上的发育及侵入过程，也参与了玉米抗病防御相关的ROS、细胞死亡及抗病基因表达水平，这为深入研究玉米对纹枯病抗病机理奠定了一定基础。然而，玉米纹枯病作为一种世界性的玉米病害难题，由于R.solani在室内人工培养条件下很难产孢，因此试验采用菌饼接种法，可能导致对病原菌侵染结构发育的观察较实际情况晚。此外，本研究采用细胞微丝骨架解聚剂间接研究了其在玉米纹枯病抗病机制中的作用。为了更清楚直观地观察R.solani接种后玉米叶片微丝骨架结构的动态变化，目前本课题组正尝试通过免疫荧光蛋白标记纹枯病菌和细胞微丝骨架，从而实现激光共聚焦显微镜实时观察纹枯病菌与玉米互作过程中微丝骨架的动态变化。

参考文献

[1] 邹军顺， 李新果， 马文峰. 中国玉米种植产业发展现状分析及政策建议[J]. 粮食科技与经济， 2014， 39 （1）： 13-15.

[2] 唐海涛， 荣廷昭， 杨俊品， 等. 玉米纹枯病研究进展[J]. 玉米科学， 2004， 12（1）： 93-96.

[3] 陈文生. 玉米纹枯病抗性资源筛选及抗性QTL元分析[D]. 成都： 四川农业大学， 2013.

[4] 肖炎农， 李建生， 郑用连， 等. 湖北省玉米纹枯病病原丝核菌的种类和致病性[J]. 菌物系统， 2002， 21（3）： 419-424.

[5] SCHMIDT S M， PANSTRUGA R.Cytoskeleton functions in plant-microbe interactions [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2007， 71： 135-148.

[6] PORTER K， DAY B. From filaments to function： the role of the plant actin cytoskeleton in pathogen perception， signalling and immunity [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2016， 58（4）：299-311.

[7] 张永梅，吴忠义，王学臣，等.拟南芥保卫细胞微管骨架的重排参与NO诱导的气孔关闭[J].科学通报，2008，53（3）：293-298.

[8] CHIMTAMANANI S， HULBERT S H， JOHAL G S， et al. Identification of a maize locus that modulates the hypersensitive defense response， using mutant-assisted gene identification and characterization [J]. Genetics， 2010， 184： 813-825.

[9] HENTY-RIDILLA J L， LI J， DAY B， et al. The plant actin cytoskeleton responds to signals from microbe-associated molecular patterns [J/OL]. PLoS Pathogens， 2013， 9（4）： e1003290.

[10] 龍书生， 曹远林， 李亚玲， 等. 小麦抗条锈病过敏性坏死反应中的活性氧代谢[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版）， 2009， 37（11） ： 125-130.

[11] NGUYEN H T， LEIPNER J， STAMP P， et al. Low temperature stress in maize （Zea mays L.） induces genes involved in photosynthesis and signal transduction as studied by suppression subtractive hybridization [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2009， 47： 116-122.

[12] SCHMELZER E. Cell polarization， a crucial process in fungal defence [J]. Trends in Plant Science， 2002， 7（9）： 411-415.

[13] HENTY-RIDILLA J L， LI J， DAY B， et al. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis [J]. Plant Cell， 2014， 26： 340-352.

[14] 郝心愿，李红莉，禹坷，等.微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用[J].中国农业科学，2011，44（2）：291-298.

[15] JAROSCH B， COLLINS N C， ZELLERHOFF N， et al. RAR1， ROR1， and the actin cytoskeleton contribute to basal resistance to Magnaporthe grisea in barley [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2005， 18 （5）： 397-404.

[16] LU Lu， WU Guanwei， XU Xiaoming， et al. Soybean actin-depolymerizing factor 2 interacts with soybean mosaic virus encoded P3 protein [J]. Virus Genes， 2015，50（2）： 333-339.

[17] MARSHALL D S， RUSHM C. Infection cushion formation on rice sheaths by Rhizoctonia solani [J].Phytopathology， 1980， 70： 947-950.

[18] KOBAYASHI Y， KOBAYASHI I. Depolymerization of the actin cytoskeleton induces defense responses in tobacco plants [J]. Journal of General Plant Pathology， 2007， 73（5）： 360-364.

[19] CHANG Xiaoli， RIEMANN M， LIU Qiong， et al. Actin as deathly switch？ How auxin can suppress cell-death related defence [J/OL]. PLoS ONE， 2015， 10（5）： e0125498.

[20] THORDAL-CHRISTENSEN H， ZHANG Ziguo， WEI Yangdou， et al. Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction [J]. The Plant Journal， 1997， 11（6）： 1187-1194.

[21] 郝重朝. 微丝骨架在黄瓜对小麦白粉菌非寄主抗性中作用的组织化学研究[D].杨凌： 西北农林科技大学， 2013.

[22] KOBAYASHI I， KOBAYASHI Y， YAMAOKA N， et al. Recognition of a pathogen and a nonpathogen by barley coleoptile cells. III. Responses of microtubules and actin filaments in barley coleoptile cells to penetration attempts [J]. Canadian Journal of Botany，1992， 70（9）： 1815-1823.

[23] 侯春燕， 王冬梅， 李小娟， 等. 细胞骨架解聚药物对小麦与叶锈菌互作诱发的细胞过敏性反应的影响[J]. 植物病理学报， 2002， 32 （2）： 147-152.

[24] TOMIYAMA K， SATO K， DOKE N， et al. Effect of cytochalasin B and colchicine on hypersensitive death of potato cells infected by incompatible race of Phytophthora infestans[J]. Annals of the Phytopathological Society of Japan， 1982， 48 （2）： 228-230.

[25] MATOUKOV J， JANDA M， FIER R， et al. Changes in actin dynamics are involved in salicylic acid signaling pathway [J]. Plant Disease， 2014， 223： 36-44.

（責任编辑： 杨明丽）