视网膜激光光凝术对贝伐单抗在兔眼内药代动力学的影响＊

陈姣 ，邓芸 ，赵雁之 ，元芳秀 ，刘维锋

(1、南昌大学第三附属医院眼科医院，南昌 330006；2、江西省妇幼保健院儿保科，南昌 330006)

糖尿病黄斑水肿（DME）是引起糖尿病患者视功能下降的主要病因。有研究表明，接受了视网膜激光光凝治疗的DME患者中，有超过15%患者仍出现进行性视力下降[1-3]。通常对该类患者进行玻璃体腔内抗血管内皮生长因子药物注射治疗，从而降低其视网膜血管的通透性，有效减轻弥漫性黄斑水肿[4，5]。然而临床工作中发现，接受过视网膜激光光凝治疗的DME患者进行玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子后对于黄斑水肿的缓解作用，显著弱于未接受过视网膜激光光凝治疗的DME患者[6]。由于贝伐单抗直接作用于眼部，其药效的发挥与药物在眼内的浓度直接相关。由此，我们推测视网膜激光光凝治疗可能影响抗血管内皮生长因子药物在眼内的处置及浓度，从而影响药效。为了证实这种推测，本研究将采用兔全视网膜激光光凝模型，通过在该模型下贝伐单抗的注射、样本采集、浓度测定、药代动力学参数计算及统计学分析，以探讨全视网膜激光光凝对眼内贝伐单抗浓度和暴露量的影响，为临床全视网膜激光光凝后玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子药物的剂量调整提供理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 兔全视网膜激光光凝模型 选取灰兔18只（36 只眼），1.5kg-2.0kg，雌雄不限，由南昌大学动物实验室提供。肌肉注射戊巴比妥钠麻醉兔，左眼用复方托吡咔胺眼液散瞳后，应用间接眼底镜532nm激光进行全视网膜光凝，光斑为Ⅲ级光斑，功率为90-120mw，时间为0.1s，平均激光点数960±130；1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 组别激光点数分别为 1090±81、984±189、938±124、1019±34、893±62、838±143，各时间段比较差异无统计学意义(F=1.75，P=0.19)。

1.2 玻璃体腔注射 视网膜激光光凝后2周双眼进行玻璃体腔注射。用1ml的注射器取0.05ml贝伐单抗，于兔眼上方角膜缘后2.5mm穿刺进入玻璃体腔，将药液注射入玻璃体腔内，拔出针头后局部用棉签压迫。术后左氧氟沙星滴眼液点眼。

1.3 样本制作 贝伐单抗玻璃体腔注射后，分别于1h、1d、2d、4d、14d 及 30d 空气栓塞处死 3 只兔子获取6眼，取出眼球用生理盐水冲洗，固定眼球，获取玻璃体、视网膜脉络膜样本，直接保存于-80°的冰箱，直至样本分析之前。

1.4 酶联免疫吸附实验 （ELISA实验）做出贝伐单抗的标准曲线；将Recombinant Human VEGF165（1.0μg/ml 100μl）(R&D Systems，lnc)包被于酶标板中，以备测定时使用；提前将样本玻璃体、视网膜脉络膜碾磨加工并稀释好；酶标板各反应孔中加入稀释样品100μl，洗涤3次；酶标板各反应孔中加入辣根酶标记山羊抗人IgG(中山金桥ZSGB．BIO)，2h后洗涤3次；酶标板各反应孔中加入显色液A和显色液B显色并终止反应；最后应用酶标仪（Rayto RT-6100酶标分析仪）读取玻璃体、视网膜脉络膜样本中吸光度值，计算得出贝伐单抗的浓度。

1.5 统计学方法 采用单因素方差分析t检验对玻璃体、视网膜脉络膜中不同时间段的贝伐单抗浓度进行统计学分析，并计算药物曲线下面积（AUC）。

2 结果

2.1 玻璃体中贝伐单抗的平均药物浓度在对照组和激光组 各时间点两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 详见表 1。

2.2 在各组织不同时间点纵向比较中，均呈下降趋势，但在激光组和对照组玻璃体中的浓度下降有统计学意义（F=5.25、15.79，P＜0.01）；而激光组和对照组视网膜脉络膜药物浓度下降差异无统计学意义（F=0.03、0.65，F=0.99、0.66），表明药物在玻璃体中的清除速率显著高于视网膜脉络膜中。

2.3 通过计算药物曲线下面积（AUC），发现药物注射30d内，贝伐单抗在对照组兔眼玻璃体中的暴露量 AUC30d 为 919.825μg/ml·d，显著高于激光组兔眼玻璃体中的暴露量（732.285μg/ml·d），差异有统计学意义（P=0.04）。激光组和对照组兔眼视网膜脉络膜中的贝伐单抗暴露量AUC30d分别是729.115μg/ml·d、724.505μg/ml·d， 经比较差异无统计学（P=0.58）。 见图 1。

表1 激光组和对照组眼内组织贝伐单抗浓度对比（μg/ml）

图1 不同组织激光组和对照组贝伐单抗暴露量比较

3 讨论

抗血管内皮生长因子药物广泛应用于眼科临床，在不同的眼科疾病中发挥不同的作用。目前，在不同的眼部环境中药物代谢动力学是否会发生改变尚未明确。有学者对玻璃体切割术后玻璃体腔中血管内皮生长因子清除率、雷珠单抗代谢清除率进行考察，发现其清除率均加快[7-9]；Chin[10]和Yang[11]进行全视网膜激光光凝（PRP）与玻璃体腔注射贝伐单抗的治疗，临床效果明显；而Pikkel[12]通过研究发现联合治疗与PRP或者抗血管内皮生长因子注射单独治疗并未见明显改善。因此，PRP是否会影响抗血管内皮生长因子药物在眼中的浓度和处置进而影响其药效，尚不明确。本研究以兔眼为模型，旨在研究PRP是否对贝伐单抗在兔眼中的处置和暴露量产生影响。

本研究结果表明，在抗血管内皮生长因子注射后第2d玻璃体贝伐单抗药物浓度在对照组的含量比激光组高，差异有统计学意义，其他时间点差异无统计学意义，表明视网膜激光可能在一定程度上加快药物清除；这和临床中激光组的疗效降低相一致，揭示了临床疗效差异的潜在原因。提示临床治疗中，对于激光治疗的患者，需要加大贝伐单抗的剂量。

多数学者研究认为兔眼单抗的药物半衰期为6d 左右[13，14]，且有效浓度能维持 3 个月[14]，这和本研究中贝伐单抗在30d内的浓度分布相一致。在本研究中，贝伐单抗在兔眼注射后，快速达到峰值，然后以较高浓度维持在兔眼中，消除缓慢，在6d左右达到最大浓度的一半。但本研究只对30d内兔贝伐单抗浓度进行检测，关于30d后PRP对贝伐单抗在兔眼内的分布和消除的影响，尚待进一步研究。

本研究存在一定局限。兔眼模型与人眼有很多不同点：兔眼玻璃体腔小、晶状体大、视网膜薄、且无血管化、无中心凹，有学者推测推测视网膜激光光凝治疗可能引起血视网膜屏障的破坏[15，16]，因此兔眼PRP对药物的影响与在人眼中相比，是否存在种属差异，尚不明确，需要进一步研究证实。