一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增(RT-RPA)技术检测菜豆荚斑驳病毒

张永江， 魏 霜， 袁俊杰， 乾义柯， 李桂芬， 魏梅生

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176； 2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东广州 510632； 3.湛江出入境检验检疫局，广东湛江 524000； 4.伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835221)

菜豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus，简称BPMV)属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)豇豆花叶病毒属(Comovirus)，其自然寄主为大豆、豇豆、菜豆等豆科植物，实验寄主多达20属25种；分布广泛，在巴西、加拿大、美国、厄瓜多尔、秘鲁等大豆产区均发现其危害[1-5]。该病毒通过汁液接触、介体昆虫及种子进行传播，根据侵染程度的不同，能够造成3%～52%的产量损失并使大豆品质降低[3]，如与大豆花叶病毒(soybean mosaic virus，简称SMV)复合侵染，可造成大豆减产85%，其在美国发生严重，在我国目前尚未发现分布[6]，已被列入新修订的植物检疫性有害生物名单中。我国是全球最大的大豆进口国，近年来，全国多个口岸检疫部门多次从进境美国、加拿大大豆中截获BPMV，目前尚无有效的病毒防治方法，一旦BPMV传入我国并定殖下来，将很难根除，加强出入境检验检疫工作是防止该病毒传入的有效途径之一。为保护我国农业生产安全，迫切须要建立一套准确快速的检测方法应用于进出口快速检疫。

目前，对BPMV的检测方法主要有生物学检测、血清学检测、电镜观察、PCR技术等，近年来多RT-PCR、重RT-PCR、免疫捕获巢式RT-PCR、环介导等温扩增等分子检测技术也被应用于BPMV的检测[7-11]。PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、可用于大量样品检测的特点，然而这种经典的技术需要复杂的温度循环仪，且检测时间较长，不符合口岸快速检测通关的要求。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，简称RPA)技术是近几年出现的一种有望替代PCR的核酸恒温扩增技术，在2006年由英国TwistDx Inc公司研发出[12]，该技术主要依赖于3种酶分别为能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶[13]，反应过程中不需要模板链的热变性，可以在恒定的低温条件下完成核酸的快速扩增，产物根据引物设计位点有特定大小的条带。经探索发现，在RPA体系中加入逆转录酶可以将RNA作为模板合成cDNA后再进行扩增，进而实现一步法扩增，利于RNA病毒核酸检测[14-15]。该技术对设备依赖程度较低，在植物病害诊断、进出口快速检疫等方面具有巨大的应用前景和市场。目前，国内利用逆转录重组酶聚合酶扩增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification，简称RT-RPA)技术检测BPMV的研究尚未见报道，本研究根据BPMV基因组的保守序列，设计特异性RPA引物，建立BPMV的RT-RPA检测方法，并验证其特异性和灵敏度，皆在建立一种快速检测BPMV的简便高效、特异性强、灵敏度高、适用于口岸快速检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜豆荚斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒(southern bean mosaic virus，简称SBMV)、大豆花叶病毒(soybean mosaic virus，简称SMV)、南芥菜花叶病毒(arabis mosaic virus，简称ArMV)及烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus，简称TRSV)大豆种子样品均保存于中国检验检疫科学研究院，同时设置阴性对照为健康大豆种子，样品经PCR检测和序列测定确认后于-80 ℃冻干保存。植物总RNA提取试剂盒为天根生物科技有限公司产品；TwistAmp Basic RT购自TwistDx Inc公司。

1.2 主要仪器与设备

金属浴(Eppendorf ThermoMixer，由Eppendorf公司提供)、电泳仪(600SI，由上海博彩生物科技有限公司提供)、凝胶成像系统(GBOX-F3，由基因公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取 参照试剂盒操作说明，提取5种病毒样品及阴性对照的总RNA，-80 ℃保存备用。

1.3.2 RPA引物设计 参考RPA引物的设计要求，根据BPMV基因组(GenBank登录号M62738.1)的保守序列，设计其RPA引物，扩增片段大小为198 bp。上游引物为BPMV-F：5′-TATTTGTATGCTATGGTGCATGATAGTTCAGTGTC-3′；下游引物为BPMV-R：5′-TGTTCTCACTGTTGCCATTTGATTCC-AAAC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3 RT-RPA检测 以“1.3.1”节中制备的总RNA为模板，采用BPMV-F和BPMV-R引物进行RT-RPA扩增，同时设置阴性对照。RT-RPA扩增体系(50 μL)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的反应管中加入再水化缓冲液(rehydration buffer)29.5 μL，去离子水14.0 μL，上、下游引物(终浓度为 0.4 μmol/L)各1.0 μL，模板RNA 2.0 μL，最后再加入醋酸镁溶液(280 mmol/L)2.5 μL。将RT-RPA扩增体系充分混匀，置于40 ℃金属浴中反应40 min。RT-RPA反应结束后，向RT-RPA扩增产物中加入50 μL苯酚/四氯化碳溶液，充分混匀后在12 000 r/min的转链下离心2 min，取 5 μL 上清液在 1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

1.3.4 RT-RPA检测方法特异性评价 按照“1.3.3”节 RT-RPA 检测反应体系，对供试样品BPMV、SBMV、SMV、ArMV及TRSV共5种病毒的总RNA进行检测，同时设置阴性对照，对所建立的RT-RPA检测方法特异性进行评价。

1.3.5 RT-RPA检测方法灵敏度评价 将BPMV样品总RNA进行10倍梯度稀释，共5个稀释度，以梯度稀释的RNA为模板，按照“1.3.3”节的反应体系进行RT-RPA灵敏度试验。

2 结果与分析

2.1 RT-RPA检测方法的特异性评价

由图1可知，BPMV样品能够检测到198 bp的特异性条带，而SBMV、SMV、ArMV、TRSV样品及阴性对照均未检测到该条带，证明该方法具有较强的特异性。

2.2 RT-RPA检测方法的灵敏度评价

由图2可知，当稀释度为10-4时，也可以检测到约198 bp的目的条带，当稀释度为10-5时，未能扩增到目的条带。

3 结论与讨论

RPA技术是一种可使微量核酸在体外恒温高效快速扩增的新技术，已被广泛应用于转基因、病原菌检测及食品安全等领域[16-20]。与基于PCR的核酸扩增技术相比，RPA技术不需要复杂的温度循环装置，操作简便、反应时间短、特异性强、敏感度高。与其他核酸恒温扩增方法(如核酸依赖性扩增检测、环介导恒温扩增、链替代扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的恒温基因扩增及转录介导的扩增技术等[21-23])相比，RPA技术不须要完成目标核酸的热变性，反应时间更短，并且可以多通道同时检测多个靶基因，检测扩增产物时可以根据不同的条件选择恰当的检测方法，非常实用。当然RPA技术从发展至今才十余年，也存在一些不足：RPA体系运行时，对体系中酶活性的要求较高，任何一种酶失活都能导致反应停止；RPA反应一般在37～42 ℃条件下进行，低温环境容易出现序列不匹配的产物[24]；RPA体系中，当目的基因含量较低时，引物之间偶尔会形成引物二聚体，可能导致非特异性产物产生[25]；利用琼脂糖凝胶电泳技术对RPA产物进行检测时，凝胶成像的结果会受到反应体系中缓冲液等组分的影响，因此须要对产物进行纯化处理[26]。

本研究建立的利用RT-RPA检测BPMV的方法，逆转录和RPA恒温扩增反应在同一反应管中连续进行，操作简单，制备好RNA后仅须配制反应体系，其后的逆转录和RPA扩增过程仅依靠简单的恒温装置即可完成，大大简化了试验流程。利用凝胶电泳法检测其扩增引物，能够检测到BPMV的特异性条带，而其他几种植物病毒的检测结果均为阴性，说明RPA方法特异性高，这是因为RPA引物设计原理虽与PCR大体相同，也一样需要上、下游2条引物，但RPA引物的长度较PCR引物长，通常由30～35个核苷酸组成，这就大大提高了RPA反应中目的基因扩增的准确度。

目前，学者们已经针对BPMV建立了多种检测方法。张明哲等利用纳米上转换荧光技术检测BPMV，检测限度为 1 μg/mL，然而检测时间需要2.5 h，且磁性纳米粒子的制备步骤较为繁琐，成本高，不适合大范围推广[27]；邓丛良等利用细菌磁颗粒实时荧光RT-PCR检测BPMV，灵敏度为10-3稀释度，但是大豆种子中蛋白质和油脂的含量高，细菌磁颗粒对BPMV粒子的吸附效果不佳[28]；易汪雪等利用单管实时荧光RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒，二者的检测限度相当，均可达到35 pg/mL，但该方法在样品中同时含有BPMV和TRSV，且在含量较低时的检测中比较有优势[29]；郭立新等利用逆转录环介导等温扩增技术检测BPMV，灵敏度为200 fg/25 μg，但该技术对引物设计要求较高，需要6条引物才能完成扩增[30]。本研究建立的 RT-RPA 检测BPMV的灵敏度为10-4稀释度，该技术检测时间短，成本低廉，引物设计简便，仅需1对引物即可完成目的基因的扩增，更适用于核酸快速检测领域，可作为口岸快速筛查菜豆荚斑驳病毒的有效手段。

4 总结与展望

我国食用油业规模巨大，大豆需求量大，须要长期大量地从国外进口，但其携带的多种病毒会威胁我国大豆产业的发展。RPA技术操作方便、特异性强、检测灵敏度高，扩增产物检测方便，虽然存在一定的缺点，但随着RPA技术的不断发展、进一步完善以及检测步骤的改良，将有望在BPMV田间诊断、口岸检验等领域得到广泛的应用，为BPMV的快速检测和一线国门检疫提供有效的技术支持。