两种胚胎装载方式对冻胚复苏移植患者妊娠结局的影响

吴海萃，张建伟，高海霞，孙振高，郭颖，石垒

(1 山东中医药大学，山东济南250011；2 山东中医药大学附属医院;3 英属哥伦比亚大学)

近年来，辅助生殖新技术、新方法层出不穷，但临床妊娠率仍徘徊在40%左右[1]。虽然妊娠与胚胎质量、子宫内膜容受性及内分泌情况等多种因素有关，但移植技术本身也是影响妊娠结局的关键因素之一[2～4]。从实验室角度考虑，移植管的类型[5]、移植过程的持续时间[6]、移植液的成分[7]、移植液的体积[8]以及移植管是否粘有血迹[9]等都是移植技术要考虑的因素，但对胚胎装载方式的关注比较少。胚胎装载是由胚胎师将胚胎从培养液被吸到移植管中，交到临床医生手中后放入子宫并释放胚胎的过程。该技术看似非常简单，但却是一个精细的操作，优化胚胎装载过程可能有助于改善妊娠结局。2015年1月～2016年12月，我们对比观察移植管直接吸取和培养液提前润洗移植管两种不同胚胎装载方式对冻胚复苏移植(FET)患者妊娠结局的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取同期在山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心行FET治疗者。入选标准：①获卵数均为5～15个；②采用体外受精(IVF)或单精子显微注射(ICSI)方法受精；③选择第3天的冷冻胚胎；④第1周期第1次移植；⑤均由同一名胚胎师装载胚胎并转交给临床医生；⑥均移植2枚胚胎；⑦排除子宫畸形、子宫肌瘤、内膜息肉及输卵管积水等情况的患者。收集患者1 362例(1 362个周期)，根据胚胎装载方式分为A组689例(689个周期)和B组673例(673个周期)。A组年龄(31.77±5.27)岁，BMI为(23.14±3.78)kg/m2；原发性不孕363例、继发性不孕326例，病程(3.49±2.55)年。B组年龄(31.25±4.76)岁，BMI为(23.19±3.73)kg/m2；原发性不孕372例、继发性不孕301例，病程(3.58±2.70)年。两组年龄、BMI、不孕类型、病程具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 辅助生殖方法

1.2.1 取卵、授精及胚胎评估 常规长方案降调节后，控制性促排卵。当双侧卵巢有3个以上直径≥1.8 cm的卵泡时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，36～38 h超声引导下穿刺取卵。取卵日男方手淫获得精液，遵医嘱行IVF或ICSI。受精后18～20 h观察原核出现情况，判断有无正常受精。第3天观察胚胎发育情况，根据细胞数目、均一性和碎片比例综合考量，选择可用胚胎(≥6分)进行玻璃化冷冻。细胞数目8～10个4分、>10个或6～7个3分、4～5个2分、2～3个1分、l个0分，碎片程度0%为4分、≤10%为3分、>10%～25%为2分、>25%～50%为1分、>50%为0分，卵裂球对称或稍不对称1分、很不对称0分。

1.2.2 玻璃化冷冻及复苏 冷冻及复苏开始前双人核对患者信息并签字，室温下采用商品化冷冻试剂盒(澳励晶贸易有限公司)操作。先将胚胎放入基础液(BS)中1 min，然后转入平衡液(ES)中5 min，最后在冷冻液(VS)里吹打；1 min内放到标记好的冷冻载杆上，放入液氮中的相应位置上。复苏时，先将载有胚胎的载杆放入37 ℃的解冻液中1 min，然后室温下稀释液1、稀释液2和洗涤液中各3 min，最后配子准备液中3 min；转入移植皿(3037)中，放入二氧化碳培养箱备用，2 h后观察胚胎存活及发育情况。

1.2.3 FET周期内膜准备 月经正常者采用自然周期，B超监测有直径≥1.8 cm的卵泡时，肌内注射HCG 8 000～10 000 U；B超监测卵泡是否排出，排卵后第3天进行胚胎移植。月经不规律者采用人工周期，月经第2天开始口服补佳乐3片，2次/d；内膜转化日为第0天，第3天进行胚胎移植。

1.2.4 胚胎装载 胚胎师与医生、护士共同核对患者信息，临床医生开始向宫腔中放置外套管时，胚胎师带无菌手套，准备装载所需的移植管、1 mL空针；待临床医生示意可以进行胚胎装管时，胚胎师进行胚胎装载。A组直接将移植管前端放入移植皿液面以下抽吸；B组先用空针抽取1 mL卵裂培养液，将液体缓缓注满移植内套管润洗管壁，回抽3 μL空气，再将移植管前端置于液面下同A组相同的步骤装载胚胎。见图1。

图1 胚胎装载示意图

1.2.5 胚胎移植与黄体支持 首先清理宫颈分泌物，用被卵裂液浸透的棉签润洗宫颈口，将移植外套管置入宫颈内口；将装有胚胎的内管穿过外套管置于距宫底1 cm处，缓慢推注，留置30 s；轻轻取出移植内套管，观察有无血迹，显微镜下检查有无胚胎残留。患者均肌内注射黄体酮注射液，移植日根据HCG日雌激素水平决定是否口服补佳乐。

1.3 妊娠结局观察 移植后第14天采血测β-HCG水平，阳性者待移植后第28天行阴道B超检测，如宫内有妊娠囊及原始心管搏动为临床妊娠。胚胎种植率=B超下孕囊数/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠患者数/移植患者数×100%；异位妊娠率=宫外妊娠患者数/移植胚胎数×100%；流产率=流产患者数/移植患者数×100%；活产率=活产患者数/移植患者数×100%。

1.4 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较行χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

A组胚胎种植率30.91%(426/1 378)、临床妊娠率49.35%(340/689)、异位妊娠率5.66%(39/689)、流产率6.10%(42/689)、活产率36.72%(253/689)，B组胚胎种植率29.57%(398/1 346)、临床妊娠率47.40%(319/673)、异位妊娠率3.27%(22/673)、流产率6.98%(47/673)、活产率36.55%(246/673)。A组异位妊娠率高于B组(P<0.05)，两组胚胎种植率、临床妊娠率、活产率、流产率差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

辅助生殖技术历经40年的发展，伴随着科技的进步，造福了无数不孕夫妇，但较低的种植率仍然困扰着辅助生殖工作者。如何提高胚胎种植率是目前生殖领域研究的热点和难点之一，移植技术是影响种植率的因素之一。虽然胚胎装载被认为是移植过程最简单的步骤，但仍对妊娠结局有影响。近些年，胚胎装载方式虽未发生较大改变，但受到越来越多的学者关注。

胚胎装载方式对成功率的影响可能有注射器的使用、移植液体的体积、蛋白浓度、装载速度、移植液的黏度以及胚胎在移植管中的位置等方面，但大部分研究多关注移植液体积和气泡位置。Ebner等[8]研究发现，气泡的存在和<10 μL的移植液对种植率和妊娠率有消极影响，>60 μL的移植液可能增加胚胎丢失的风险。Montag等[10]研究显示，与15～20 μL的移植液相比，40 μL者胚胎种植率和妊娠率均较高。另外，一些临床医生认为移植管中的气泡可使超声引导的移植过程更易观察,还有学者提出了一种只用气泡的新型装载方式。胚胎装载速度是指胚胎从培养液面下被吸入到移植管中对应位置的速度。Groeneveld等[11]研究发现，不同移植者的胚胎装载速度是不同的，这是否与不同移植者之间成功率的差异有关，其具体机制值得进一步探讨。移植管是否提前润洗，移植液的黏度[12,13]会有变化，有可能影响胚胎推送的速度，影响胚胎在子宫腔的位置[14]。Zhu等[15]研究发现，胚胎植入子宫后子宫蠕动波频率与液体位置的改变呈正相关，这可能对胚胎移植患者的妊娠结局有影响。另外，移植管内气柱和液柱的体积和排列对妊娠结局也有影响[16]。Montag等[10]报道，较高的液体移植量可提高临床妊娠率和种植率。

本研究是关于移植内套管直接吸取液体及胚胎与移植液提前润洗移植内套管对临床妊娠结局的影响，发现移植管提前润洗可明显降低患者的异位妊娠率。根据本研究结果和以上分析，我们推测，移植管提前润洗可影响培养液的黏度和浓度，使胚胎的装载和推送速度不同，这可能影响到胚胎在子宫中的着床位置；另外，移植管提前润洗可降低推送压力，并保证均匀的胚胎推送力度，避免了突然过大的推动冲力使胚胎附着于离输卵管开口较近的位置，从而降低异位妊娠率。对比观察两种胚胎装载方式，移植管提前润洗的患者流产率有升高趋势，虽无统计学意义，但此趋势是否与提前润洗移植管导致胚胎游走速度增快有关，尚需进一步探讨。

综上所述，胚胎移植前移植管提前润洗可明显降低异位妊娠率，这是否与移植管提前润洗改变胚胎推送速度和感受的压力，进而影响胚胎在子宫的着床位置，值得进一步探讨。下一步可设计自动推送模型，模拟人为操作过程，探讨其中的机制。