兔自体BMSC移植修复前交叉韧带损伤效果及对血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平的影响

史开宇，赵其纯

(1 安徽医科大学，合肥230032;2 安徽省立医院)

前交叉韧带损伤是临床较常见的运动损伤，但因疼痛不明显易导致误诊，使患者错过最佳的治疗时期而延误治疗[1]。前交叉韧带损伤因缺少血液供应，损伤后多不能自行愈合，可通过手术重建治疗。但是，术后愈合速度受多种因素的干扰，包括神经营养、重建肌腱的血液供应、炎性物质的产生等[2]。骨髓间充质干细胞(BMSC)是一种多功能干细胞，可以自我完成更新和分化。尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)可水解纤维蛋白溶酶原，可促进基质降解和炎症反应；转化生长因子β(TGF-β)对细胞有丝分裂有重要作用，可加强损伤处愈合；白细胞介素1(IL-1)可增加代谢因子的表达，调节软骨细胞功能；IL-4加速B细胞分裂，增强免疫系统的功能，还可诱导未分化细胞向髓样细胞分化。因此，血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平可以间接反映修复效果。2018年3～6月，我们建立了前交叉韧带损伤兔模型，观察自体BMSC移植修复前交叉韧带损伤的效果及对这些因子的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 健康成年雄性新西兰大白兔60只(天津市百农实验动物繁育科技有限公司)，兔龄为11～12个月，体质量3.2～3.8 kg。主要试剂、仪器：兔抗大鼠u-PA抗体(天根生化科技有限公司)，小鼠抗大鼠TGF-β抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，大鼠抗小鼠IL-1、IL-4抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，ELISA试剂盒(上海国药集团化学试剂有限公司)；WDW-100微机控制电子万能生物力学试验机(济南时代山峰仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养与分组 动物饲养温度为22～25 ℃，室内湿度35%～40%；饲养室定时进行紫外线照射消毒，分笼饲养；统一喂食标准颗粒饲料，自由活动；逐个检查兔的四肢健康情况，确保膝关节无肿胀畸形，双膝关节抽屉试验、Lachman征阴性。将兔随机分为正常组、模型组和移植组各20只，另养2只兔备用以保证数据的完整性，所有操作符合动物伦理学标准。

1.2.2 前交叉韧带损伤模型制备 将模型组和移植组兔固定在动物固定架上，耳缘静脉注射3.3%的戊巴比妥钠进行全麻；右前肢关节处做脱毛处理，肌内注射青霉素预防感染。用手术刀在右前肢的膝关节髌旁内侧做纵切口，切断前交叉韧带，暴露股骨和胫骨附着点。分离趾长伸肌腱并切断远端，完整保留股骨端附着处，用4-0 Ethibond 缝合线缝合断端。测量并记录肌腱直径，使用与之匹配的钻通过前交叉韧带在股骨和胫骨的附着点，建立股骨和胫骨隧道。在兔胫骨嵴上钻孔，使膝关节屈曲30°，拉入趾长伸肌腱，在胫骨桥上打结固定。术后无动物死亡，1只感染，备用补充保证样本量。

1.2.3 兔自体移植用BMSC的获取与制备 参考孙经淞等[3]的培养方法，并作适当修改。在无菌条件下，抽取移植组兔骨髓5 mL，以1 500 r/min离心5 min，将分离的细胞接种于盛有低糖DMEM培养液的50 mL培养瓶(细胞密度5×105/cm2)中,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞铺满瓶底90%时，加入0.25%胰蛋白酶。将3 mL DMEN液注入生物蛋白胶，充分溶解后密封在EP管中，每支EP管装有液体200 μL，-50 ℃冰箱保存。把2 mL纤维蛋白、0.5 mL凝血酶和2 mL细胞悬液混合成有固体强度的生物蛋白胶，再加入适量DMEM液，继续放置在培养箱中观察。

1.2.4 细胞移植 模型成功建立后，收集第3代BMSC约1×107，以1 500 r/min离心10 min；弃上清液，取底部的细胞团，与200 μL的纤维蛋白原混合均匀；用两支2.5 mL的空针分别抽取细胞悬液和催化剂，同连接器相连，将细胞注入移植组的胫骨和股骨隧道内。以同样方法在模型组胫骨和股骨隧道内注入生物蛋白胶，正常组不做任何处理。治疗期间，各组动物均自由饮食。

1.2.5 血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4检测 术后第2、4、6、8周清晨抽取空腹后肢胫部皮下静脉血5 mL，迅速转移至生化管内，以2 500 r/min离心15 min。移取上清液，-50 ℃冰箱保存待检。采用SABC法检测u-PA，ELISA法检测TGF-β、IL-1、IL-4，严格按说明书操作。

1.2.6 前交叉韧带力学测定 术后各时点采血后每组分别处死5只，留取右前肢的膝关节；用生理盐水纱布包裹立即送生物力学实验室，用WDW-100微机控制电子万能生物力学试验机测试。固定好待测部位后，以5 mm/min的速度进行最大载荷拉伸试验，记录前交叉韧带完全断裂时的加载负荷。

2 结果

2.1 各组术后不同时点血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平比较 术后2、4、6、8周时，移植组和模型组血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平逐渐降低，并向正常组水平趋近；术后同一时点血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4比较，模型组>移植组>正常组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组术后不同时点血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平比较

注：与同时点正常组比较，aP<0.05；与同时点模型组比较，bP<0.05。

2.2 各组术后不同时点前交叉韧带再次断裂所需拉力比较 术后2、4、6、8周，移植组和模型组前交叉韧带再次断裂所需拉力均逐渐增大，并向正常组水平趋近；术后同一时点前交叉韧带再次断裂所需拉力比较，模型组<移植组<正常组(P均<0.05)。见表2。

表2 各组术后不同时点前交叉韧带再次断裂所需拉力比较

注：与同时点正常组比较，aP<0.05；与同时点模型组比较，bP<0.05。

3 讨论

随着社会的不断发展，发生交通事故和参加体育锻炼的人数增加，韧带损伤发生率也逐年增加，且大多数为膝部韧带损伤[4]。其中，90%的膝部韧带损伤发生在前交叉韧带和内侧副韧带，前交叉韧带是最易受伤的韧带，占膝关节韧带损伤的一半以上。前交叉韧带损伤后不能自愈，需通过手术才能恢复其功能[5]。MSC是胚胎发育过程中在多种成体间叶组织(如骨髓基质、胎盘、脐带血等)中留存下来的未分化的原始多能细胞，具有长期自我更新和发生多向分化的潜能[6]。自体BMSC移植是自身抽取留存于骨髓中的MSC，经培养、纯化后再次注入患者体内，是一种用于治疗免疫性疾病的前沿疗法[7，8]。

纤维蛋白组织的形成属于一种病理现象，在血液凝结、血栓形成、炎症反应和组织修复中起重要作用。在皮肤和骨组织的修复中均能观察到纤维蛋白组织的形成，其形成和降解之间存在着一种动态平衡，纤维蛋白溶酶对纤维蛋白的降解起到一定调控作用[9]。u-PA对纤维蛋白溶酶原有水解作用，促进其转化成纤维蛋白溶酶，还参与炎症反应和基质的降解过程[10]。本研究显示，移植组血清u-PA低于同时点模型组，且逐渐接近正常组水平。这提示自体BMSC移植可促进大白兔损伤处的恢复，使损伤处的微环境逐渐恢复平稳状态，u-PA的表达也逐渐向正常水平趋近。TGF-β是由两条蛋白质链组成的二聚体，两个亚单位的结构相似，由二硫键连接[11]。TGF-β可诱导细胞发生有丝分裂，调节组织液的产生，维持机体内环境稳定，加速细胞分化以及成熟，促进肌腱、骨创伤处的愈合[12，13]。本研究显示，移植组血清TGF-β低于同时点模型组，且逐渐接近正常组水平。这可能是损伤处内环境逐渐恢复正常，肌腱和软骨逐渐恢复正常，对TGF-β的调节需求减弱，TGF-β逐渐降低。

IL-1主要来自单核巨噬细胞，也可以来自软骨细胞、滑膜细胞等。其本质是一种多肽，有激素样作用。IL-1可以调节软骨细胞的功能，诱导基质金属蛋白酶的产生，增加代谢因子的表达，促进软骨基质降解，致使软骨退化[14]。本研究显示，移植组注入BMSC和生物蛋白胶的混合物后，其血液中单核巨噬细胞、软骨细胞、滑膜细胞对IL-1的表达水平逐渐趋于正常，损伤处的软骨基质降解减少，损伤处在不断恢复。IL-4来源于T淋巴细胞，可促进B淋巴细胞的有丝分裂，并增强B细胞提呈抗原能力，增加免疫系统对小量抗原的免疫应答反应[15]。IL-4还可以与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子发生协同作用，促进骨髓造血前体细胞有丝分裂，对髓样细胞定向分化有诱导作用。本研究结果显示，移植组注入BMSC和生物蛋白胶的混合物后，损伤处细胞表达活动逐渐趋于正常，T淋巴细胞对其表达逐渐减少，损伤处在不断恢复。

治疗后定期测量前交叉韧带损伤处再次断裂所需拉力，可以代表损伤处的恢复情况。本研究结果显示，术后同一时点前交叉韧带再次断裂所需拉力比较移植组大于模型组。这提示自体BMSC移植后损伤处细胞分裂增殖速度增加，腱骨界面胶原纤维数量增加，肌腱强度逐渐增强。因此，兔自体BMSC移植可有效修复前交叉韧带损伤，并可有效降低兔血清u-PA、TGF-β、IL-1、IL-4水平，对前交叉韧带损伤的手术恢复有重要参考价值。