不同护肤技术组合对SKH-1小鼠皮肤光保护作用的初步研究

黄慧莹 ，梁燕珊 ，吴美音 ，施琬 ，郑亚美 ，陈亚非

1.广州中医药大学针灸康复临床医学院针灸推拿，广东广州 510000；2.无限极（中国）有限公司，广东广州 510665；3.广州宏韵医药科技股份有限公司，广东广州 510663

皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，能吸收、分泌、排泄、感觉、参与代谢等，同时具有重要的屏障和防御功能：一方面防止体内水分，电解质和其他物质丢失，另一方面使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭[1-3]。皮肤衰老是一个复杂的生物学现象，主要表现为肤色黯淡，皮肤变薄、皱纹增多、弹性下降，毛细血管显露，易脱屑、瘙痒，常见色斑及疣状物，严重者甚至产生皮肤紫癜及癌变[4-5]。

阳光是一把双刃剑，在带来光明和能量的同时，其中的紫外线（ultraviolet，UV）也可导致皮肤光损伤。皮肤暴露于紫外线下会产生大量活性氧（Reactive Oxygen Specie，ROS）。正常情况下，UV 照射机体产生的ROS可被体内抗氧化防御体系所清除。当UV反复照射皮肤，超出机体抗氧化体系的防御清除能力时，累积的ROS可造成细胞内蛋白质、核酸等大分子物质氧化损伤，从而导致一系列急慢性损伤表现。皮肤光损伤长期累积可导致光老化甚至是光致癌[6]。

皮肤光损伤严重影响了人们的美观和健康，是人们普遍关注的热点问题，对它的防治进行研究十分有必要。在皮肤问题的治疗和护理上，目前正在经历从传统的单一护肤品治疗向联合治疗，再向多学科综合治疗的转变。皮肤问题既是局部变化，又是全身整体失衡的外在表现，护肤不仅仅是采取单一方法甚至极端方法即可奏效的。当前，皮肤治疗和护理的手段有很多，包括护肤品、口服美容食品及各类医美技术等，采用多种技术手段的综合治疗有助于提高皮肤治疗和护理效果。因此，如何将现有各种美丽技术与方法分门别类并有机地结合起来，取长补短，实现整体美丽是目前多学科、跨品类综合运用的迫切要求。

该实验研究周期为2017年5—7月，共选取SKH-1小鼠33只，以护肤品、美容技术和美容食品等不同技术及组合干预SKH-1小鼠皮肤光损伤过程，通过组织病理变化、表皮厚度变化等指标初步评价不同护肤技术抗小鼠皮肤光损伤的作用差异，为提供更科学的护肤技术及其组合提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 护肤品：萃雅菁颜无痕焕能活肤液、萃雅菁颜无痕至臻弹力精华乳、萃雅菁颜无痕卓能修复晚霜，生产批号为16G25CAP01，均由无限极（中国）有限公司提供；美容食品：美姿力胶原蛋白果味饮料，生产批号为15F08A02H，由无限极（中国）有限公司提供；美容仪器：660 nm红光美容仪（Syneron Beauty Inc，型号 90208），微电流美容仪（Carol Cole Company，型号 P0144791）；荧光灯管（FS40，National Biological Corp.，Twinsburg，OH）； 分光光度计（Luzchem Research，Inc，Ontario，Canada）； 紫外线强度检测仪 （Oriel Instruments，Stratford，CT，USA）；福 尔 马 林（Fisher，22-899-401）；石蜡（Tissue-Tek，62580-01）；乙醇（Fisher，A406p-4）；二甲苯（Fisher ，x3p-1gal）；苏木精染液（Sigma，HHS32-1L）；伊红染液（Anatech，832）。

1.1.2 动物 SPF级 6～7周龄 SKH-1无毛小鼠，由Charles River提供，体重20 g左右。饲养于芝加哥大学SPF级动物屏障室中，光照充足，自由饮食饮水。所有动物实验得到芝加哥动物护理与使用委员会批准，并在芝加哥大学完成。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药 护肤品：活肤液100 μL/（只·次）；精华乳 0.1 g/（只·次）；晚霜 0.05 g/（只·次）。 使用棉签涂抹并轻轻按摩至皮肤完全吸收为止。使用顺序：活肤液→精华乳→面霜。

美容技术：①红光美容技术：660 nm，3 min/次，1次/d；②微电流美容技术：使用 3档，5 min/次，1次/d，每次使用前在皮肤上涂抹适量凝胶。

美容食品：300 μL/只/次，灌胃给药，1 次/d。 给药剂量是按《中药药理研究方法学》提供的人与小鼠等效剂量比值计算而得，即小鼠的等效剂量相当于人的9.1倍，该灌胃剂量相当于人体2支/d（即100 mL/60 kg）的用量。

不同护肤技术使用顺序如下：食品→美容技术→护肤品。

将33只SKH-1无毛小鼠按体重随机分成11个组，每组3只，分别为模型组（Model）和10个给药组，给药分组如下：护肤品组 （SC）、红光美容技术组（RL）、微电流美容技术组（MC）、美容食品组（BF）、护肤品+红光美容技术组（SC+RL）、护肤品+微电流美容技术组（SC+MC）、红光美容技术+美容食品组（RL+BF）、微电流美容技术+美容食品组（MC+BF）、护肤品+红光美容技术+美容食品组 （SC+RL+BF）、护肤品+微电流美容技术+美容食品组（SC+MC+BF）。

参考文献[7-8]，除模型组外，各治疗组按分组进行给药，连续给药5 d。于实验第4天给药前，使用UV于小鼠背部照射2.5 min（光源距离小鼠背部皮肤27 cm，辐射强度0.67 mW/cm2）。实验第6天不给药，使用UV照射2.5 min后处死小鼠，观察小鼠皮肤形态学变化，并取背部皮肤组织进行病理分析。

1.2.2 HE染色 取一小块小鼠背部皮肤组织，置于10%福尔马林中固定过夜，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋、5 μm石蜡切片，苏木精-伊红染色。观察皮肤的病理改变、测定表皮层厚度。

1.3 病理分析

①每个样本片随机选取5个区域用于表皮层厚度测量（×20）。②对于每个区域，各随机选取5个测量点，通过ImageJ软件分析对应表皮层厚度。③计算各组的均数和标准差。

1.4 统计方法

采用GraphPad Prism 6.01软件对数据进行单因素方差分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行t检验，以α=0.05为检验水平，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤形态学变化

通过肉眼观察，Model组小鼠背部皮肤明显粗糙萎缩、变薄，缺乏光泽，没有弹性，表面纹理增多，且皮肤有破溃和红斑表现。与Model组比较，各治疗组小鼠背部皮肤变得较为细腻，厚度增加，弹性恢复，表面皮肤纹理变浅、皱纹也有不同程度的减少。其中，以SC+RL+BF组皮肤改善较好，已明显恢复红润光泽，厚度适中，具有良好的皮肤弹性（见图1）。

图1 各组小鼠皮肤形态学变化图

2.2 皮肤组织病理学观察与表皮层厚度测定

2.2.1 组织病理学观察 Model组小鼠背部皮肤表皮层厚度减小，角质层缺失较多，真皮层纤维弯曲、排列紊乱。RL、MC、BF 3组小鼠背部皮肤表皮层厚度无明显变化，角质层部分缺失，真皮层纤维较疏松。其余7个治疗组小鼠背部皮肤表皮层增厚，结构完整清晰，角质层部分缺失较少，真皮层纤维排列整齐。结果表明，各治疗组对角质层缺失有一定的改善作用，使角质层结构趋于完整（见图2）。

2.2.2 表皮层厚度测定 与Model组比较，除RL、MC、BF 3组外，其余各治疗组小鼠的表皮层厚度均有不同程度的增加，尤以SC、SC+MC、RL+BF和SC+RL+BF四组对表皮厚度的改善作用最为显著 （P＜0.05）（见表 1）。

图2 各组小鼠背部皮肤组织病理图（HE染色，×20）

表1 各组小鼠背部皮肤表皮层厚度测定[（±s），μm]

表1 各组小鼠背部皮肤表皮层厚度测定[（±s），μm]

注：*P＜0.05，**P＜0.01，vs Model组。

组别表皮层厚度M o d e l（n=3）S C（n=3）R L（n=3）M C（n=3）B F（n=3）S C+R L（n=3）S C+M C（n=3）R L+B F（n=3）M C+B F（n=3）S C+R L+B F（n=3）S C+M C+B F（n=3）1 5 4.9 9 3±1 2.5 2 5(2 7 1.0 3 8±3 5.6 4 2)**1 5 3.7 2 3±6.9 9 3 1 4 2.0 8 5±2 6.9 4 2 1 5 5.7 9 0±2 5.7 9 0 2 5 8.9 8 9±4 2.2 3 6(3 0 3.2 1 3±4 7.0 8 2)**(1 9 0.7 4 0±1 3.1 1 3)*1 7 9.2 2 0±2 2.4 3 1(2 9 4.1 9 0±6 6.6 7 0)*2 0 2.2 7 5±5 9.3 0 5

3 讨论

表皮是皮肤的外层，能防止外界异物入侵，过滤、吸收紫外线，分裂增生细胞等，皮肤老化过程中表皮层逐渐变薄，天生表皮层较薄的人皮肤也更容易出现衰老症状，因此保证一定的表皮层厚度能预防或延缓衰老。角质层是表皮的最外层，皮肤的第一道防护网，能阻挡外界微生物的侵袭和自然水分的流失，同时具有一定的抗氧化功能[9-10]，对皮肤屏障作用的发挥具有重要意义[11]。角质层缺失时肌肤水分流失加速，容易产生缺水、干燥、粗糙、弹性降低等一系列皮肤问题，因此保持角质层的完整性对维持皮肤的屏障功能、防止光损伤具有重要意义。

结合实验结果分析：①表皮层厚度：模型组的表皮层厚度为[（154.993±12.525）μm]。 使用单一护肤品[SC：（271.038±35.642）μm]、护肤品+微电流美容技术[SC+MC：（303.213±47.082）μm）]、红光美容技术+美容食品[RL+BF：（190.740±13.113）μm]、护肤品+红光美容技术+美容食品 [SC+RL+BF：（294.190±66.670）μm]能明显提升光损伤小鼠表皮层厚度（P＜0.05），初步提示护肤品和不同护肤技术组合使用对光损伤小鼠皮肤表皮层厚度的改善作用更好。然而单一的红光技术、微电流技术和美容食品则对表皮层厚度影响不大，经分析这可能与治疗时间较短有关。其中，美容技术激活细胞，对皮肤的再生修复方面作用并非一朝一夕能完成，美容食品调节人体并体现在面部肌肤上需要一个较长期的过程。②角质层结构完整性：组织病理结果提示，不同护肤技术及其组合干预后，光损伤小鼠皮肤内在结构、角质层完整性、皮肤再生状况、真皮层纤维排列和表皮层厚度均有较为明显的改善趋势，此在某种程度上类似受损后的皮肤再生，这些变化发生后皮肤可能出现自我修复，从而达到真皮胶原纤维、弹性纤维再生重塑的作用，其中尤以护肤品+微电流美容技术、护肤品+红光美容技术、护肤品+微电流美容技术+美容食品、护肤品+红光美容技术+美容食品更为明显。

吴海游等人[12]通过紫外线照射导致小鼠皮肤损伤的实验观察3种含辅酶Q10的防晒剂具有抗小鼠皮肤紫外线损伤的作用，模型组小鼠皮肤角质层则明显脱落，涂抹防晒剂后，角质层脱落得到不同程度的改善。孙程等人[13]采用D-半乳糖联合紫外照射诱导KM小鼠的皮肤衰老模型，导致模型组小鼠表皮变薄（9.56±1.47）μm，茶树提取物 TTE 经皮给药后，表皮厚度显著变厚，TTE低剂量组和高剂量组的表皮厚度（16.81±3.39）μm 和 （26.80±3.93）μm。 该实验以紫外线照射造成小鼠皮肤光损伤，表现为粗糙、变薄，表皮层厚度减小，角质层缺失，真皮层纤维排列紊乱，表明模型符合光损伤模型特点；而经不同护肤技术及其组合干预后，光损伤小鼠皮肤的外在表现、以及表皮层厚度、角质层缺失状况、真皮层纤维排列方式等均有不同程度的改善，与单一使用防晒剂或护肤品相比，对皮肤的光保护作用更加系统和全面。

该实验所选用护肤品的核心功效成分为多肽复合体（寡肽-1、棕榈酰五肽、肌肽等），具有良好的抵抗自由基和皮肤修复能力。口服美容食品的核心功效成分为胶原蛋白，通过内源性补充，可提供给皮肤细胞新陈代谢所需营养因子。红光美容技术为LED红光，波长660 nm，又称生物活性光，可有效激活逐渐退化的皮肤细胞活性，激发人体自身修复功能；同时，细胞中的线粒体对红光吸收最大，在红光照射后线粒体的过氧化氢酶的活性增加，进而增加细胞的新陈代谢，使糖原含量增加，蛋白合成增加和三磷酸腺苷（ATP）分解增加，从而加强细胞新生[14]。微电流美容技术则是利用仪器所产生的微电流作用于皮肤时，会在局部皮肤内形成一种低量电环流，这种低电环流模拟人体内生物电的自然流动情况，具有即时效果和累积效果；微电流通过面部刺激，将轻柔的电流经皮肤、组织一直到传送到面部肌肉中，刺激ATP的产生，进而驱动关键结构蛋白（胶原蛋白和弹性蛋白等）的再生[15]。

综上所述，预防或延缓皮肤衰老并不能只采用单一的护肤品、美容技术或者美容食品，应从整体出发，将多种护肤技术有机结合。该实验中护肤品、美容技术及美容食品2～3种组合对皮肤光损伤可起到更全面的保护效果，多种护肤技术组合能更好的发挥各自的优势，这为护肤技术的组合应用提供了重要的实验依据，但其作用机理还有待进一步研究。