浙江秀珍菇黄菇病病原菌的分离与鉴定

袁卫东，陆 娜，宋吉玲，王伟科，亢学平，闫 静，李戌清，*

(1．杭州市农业科学研究院，浙江杭州310024;2．延边朝鲜族自治州农业科学院，吉林龙井133400)

秀珍菇(Pleurotus geesteranus)，又名姬菇、小平菇，其营养丰富，味道鲜美，深受广大消费者喜爱，是浙江省重要的食用菌栽培品种之一。近年来，随着秀珍菇栽培规模的不断扩大，栽培中出现的病害尤其是黄菇病造成的危害越来越严重。病害发生初期，局部现淡黄色斑点，病部黏湿;后期菇体腐烂，现黏稠状分泌物，并伴有恶臭味。病害的发生不仅降低了子实体产量，而且严重影响品质，给秀珍菇生产造成了巨大损失，严重影响了菇农的经济效益和种菇积极性。

目前，已报道的食用菌斑点病大多是由假单胞杆菌引起的细菌性病害，如托拉斯假单胞杆菌(Pseudomonas tolaasii)引起的蘑菇褐斑病［1］，姜黄色假单胞菌(P．gingeri)引起的双孢蘑菇黄斑病［2］，蘑菇假单胞菌(P．agarici)引起的菇姜黄色斑点病［3］，荧光假单胞菌(P．fluorescens)引起的平菇黄腐病［4］，布氏假单胞菌(P．brenneri)引起的香菇褐斑病［5］，恶臭假单胞菌(P．putida)和边缘假单胞菌(P．marginalis)引起的杏鲍菇斑点病［6］等。为明确浙江秀珍菇黄菇病病原菌种类，为秀珍菇黄菇病的有效防控提供理论依据，笔者开展了病原菌的分离纯化、致病性测定、质谱鉴定、脂肪酸甲基酯(fatty acid methyl ester，FAME)鉴定及16S rRNA序列分析等系统研究。

1 材料与方法

1．1 材料

恶臭假单胞杆菌标准菌株Pseudomonas putida ATCC12633，来自中国典型培养物保藏中心;秀珍菇菌株为台秀57-FJLY，来自福建省罗源县。

细菌分离纯化采用NA培养基(配方:酵母粉1 g、牛肉膏 3 g、蛋白胨 5 g、蔗糖 10 g，加ddH2O补至1 000 mL，并调整pH至7.0)。菌落培养采用King's B培养基(配方:蛋白胨20 g、磷酸氢二钾1.5 g、硫酸镁1.5 g、甘油10 mL、琼脂15 g，加ddH2O补至1 000 mL);MBT鉴定采用TSA培养基(配方:胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 g，加 ddH2O 补至 1 000 mL，并调整pH至7.3±0.2);FAME鉴定采用TSBA培养基(配方:胰蛋白胨大豆肉汤30 g、琼脂15 g，加ddH2O补至1 000 mL)。

1．2 病原菌的分离与形态观察

2016年底，从浙江省淳安县发病的秀珍菇菇房内采集新发病的菇包，作为病害诊断和病原菌分离的样品。在NA培养基上划线分离培养，每个菇包划2个培养皿，每个培养皿上挑取1个单菌落纯化，共获得10个菌株。革兰氏染色、菌落形态和部分细菌学特征测定参照Schaad等［7］的方法。

1．3 致病性鉴定

用39%棉籽壳、39%木屑、20%麸皮及2%石灰组成培养料，将含水量控制在60%左右，搅拌均匀后装入18 cm×38 cm的聚乙烯塑料袋中，100℃常压灭菌10 h。然后接入秀珍菇菌株(台秀57-FJLY)，置于28℃人工气候箱中培养。待菌丝长至菇包口，形成菌膜即将出菇时，去除菌膜，用一次性注射器接入1.2节分离的各菌株悬浮液(浓度为3 ×108cfu·mL－1)10 mL，每菌株重复3个菇包。另取3个菇包接入10 mL无菌水作为对照。在28℃、相对湿度85%的人工气候箱中继续培养，从第3天开始每天观察记录病情发展情况，并从发病菇包中重新分离病原菌进行验证，病原菌分离方法同1.2节。

1．4 MBT 鉴定

从1.3节鉴定的秀珍菇黄菇病菌中选取5个代表菌株进行全自动快速微生物质谱检测系统(MALDI Biotyper，MBT)鉴定。各菌株在 TSA培养基上培养24 h，挑取单菌落加入含300 μL ddH20的1.5 mL EP管中，混匀后加入900 μL无水乙醇，混匀后 10 000 r·min－1离心 2 min，弃去上清液。加入50 μL 70%甲酸，混匀后再加入50 μL 乙腈，混匀后10 000 r·min－1离心 2 min，吸取上清液到另一干净的1.5 mL EP管中。吸取1 μL上清液置于MALDI样品靶上，放干后取1 μL基质溶液用于测定。鉴定结果用FAV 3.0(flex analysis version)和MBV2.0 SR(MALDI BioTyper Version 2.0 SR 1)分析。将分析结果与数据库(Biotyper)中储存的标准菌种的质谱信息进行比对。

1．5 FAME 鉴定

FAME鉴定采用美国Agilent 6890N气相色谱系统，参照 MIDI(microbial identification system)公司说明书进行。纯化的5个代表菌株在NA培养基上30℃培养24 h，后转入含有3%胰蛋白酶的TSBA培养基上再培养24 h。然后用直径4 mm的无菌塑料接种环挑取一环培养菌放入干燥的有螺帽的试管底部，提取脂肪酸。鉴定结果通过MIDI Sherlock 6.0微生物鉴定系统软件获得。将分析结果与数据库(TSBA6 6.00)中储存的标准菌种的脂肪酸信息进行比对。

1．6 16S rRNA 序列测定

采用细菌16S rRNA基因的通用引物对27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')［8］和 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')［8］，对分离的秀珍菇黄菇病病原菌进行PCR扩增。扩增反应体系为:Redmix E 25 μL，27F 1.25 μL，1492R 1.25 μL，DNA 2 μL，加 ddH2O 补足至50 μL。反应条件为:94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环;72℃ 10 min。PCR反应在S1000 Thermal Cycler BIO-RAD型PCR仪上进行，取3 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的序列利用Chromas编辑校正，用Clustal W程序进行rDNA序列联配比较，用DNAstar和Mega 6.0软件进行系统进化分析。

2 结果与分析

2．1 病害症状

秀珍菇菇包发病时，菇包处于菌丝生长阶段，表现为袋口附近出现零星黄色水珠，水珠黏度不大。随着病害向下扩展(一般可扩展至菇包的1/2左右)，黄色水珠黏度加大(图1)。病害通常导致菌丝长满菇包的时间延长7 d左右。发病菇包在菌丝长满，进入出菇环节后，经过消毒仍可长出子实体;但随着子实体的增大，菇体会出现大量黄色黏稠状水珠，使菇体腐烂，并使与之相邻的健康菇体发病。

2．2 病原菌的细菌学特征

5个菇包共分离纯化出10个菌株，这些菌株革兰氏染色反应均呈阴性，菌体杆状，具1～2根极生鞭毛，能游动，好氧，不产生芽孢。在NA培养基上30℃培养24 h，菌落半透明，淡黄色，表面略隆起，边缘光滑，圆形。在King's B培养基上可产生荧光素。培养3 d后的培养基伴有明显的腥臭味。

2．3 致病性

致病性测定结果表明，在接种后第5～6天，菇包开始发病，有少量不黏稠的黄色水珠产生，并伴有恶臭味。接种无菌水的对照菇包无明显变化。从接种发病的菇包上可分离获得与接种菌株相同的病原菌。

图1 被污染的菌包样品Fig．1 Polluted mushroom package samples

图2 平板上培养的菌株形态及革兰氏染色结果Fig．2 Characteristics of strains cultured on NA plate and gram staining reaction

2．4 MBT 鉴定

MBT鉴定结果通过Biotyper软件进行分析，最终结果为数据库中与样品最为匹配的几个细菌种属，并给出相应的分数。分数介于2.300～3.000，能完全可靠地鉴定到种的水平;介于2.000～2.299，能可靠地鉴定到属的水平或有可能鉴定到种的水平;介于1.700～1.999，有可能鉴定到属的水平;介于0～1.699，表示没有可信的鉴定结果。标准菌株的MBT鉴定结果与原鉴定完全一致，分值为2.083。5个秀珍菇黄菇病分离菌代表菌株的MBT鉴定结果显示，它们均被鉴定为 P．putida，MBT分值在 2.003～2.115，接近或高于标准菌株，具有较高的可信度(表1)。

2．5 FAME 鉴定

FAME鉴定结果匹配程度遵循Buyer等［9］的原则:相似性系数＜0.2，结果不可用;相似性系数≥0.2，可鉴定到属;相似性系数≥0.5，可鉴定到种。标准菌株的FAME鉴定结果与原鉴定完全一致，FAME相似性为0.623。5个代表菌株的FAME鉴定结果表明，他们均属于 P．putida，FAME的相似性介于0.809～0.869，均高于标准菌株(表1)，且FAME鉴定结果与MBT鉴定结果完全一致。

2．6 16S rRNA 序列分析

分离获得的5个黄菇病菌代表菌株经PCR扩增均得到一条约1.5 kb条带(图3)。所得条带经序列测定后与GenBank中相近种进行blast比对并构建系统发育树，结果(图4)显示:5个代表菌株 ZJ-01、ZJ-02、ZJ-03、ZJ-04和 ZJ-05与 P．putida标准菌株在系统发育树中聚在同一分支上，且与GenBank中已登录的P．putida序列亲缘关系最近，在系统发育树中聚在同一分支上。

表1 秀珍菇黄菇病病原的MBT和脂肪酸鉴定结果Table 1 MBT and FAME identity of the pathogens causing yellow rot disease in Pleurotus geesteranus

图3 五个代表菌株16S rRNA电泳图Fig．3 Electrophoresis of 16S rRNA region PCR products of 5 typical strains

3 讨论

秀珍菇含有丰富的氨基酸、蛋白质和矿物质等营养成分，具有滋补身体和安神除烦等功效，可降低肿瘤、高血压和糖尿病等疾病的发生［10－12］。近年来，秀珍菇深受我国城乡居民的喜爱，已成为明星菜［13］。由于高产高收，菇农们种植秀珍菇的热情空前高涨。然而，随着种植的规模化，秀珍菇黄菇病常有发生，且病害扩展非常迅速，常使整个菇房甚至整个生产基地只菇不收，菇农绝收［13－15］。因此，明确秀珍菇黄菇病的病原菌可为病害的有效防控提供理论依据。

本研究对采自淳安秀珍菇菇包的黄菇病病原菌进行常规分离纯化鉴定，并结合MBT鉴定、FAME鉴定和16S rRNA序列分析，明确了恶臭假单胞菌P．putida是引起浙江省秀珍菇黄菇病的病原菌。这与姚璐晔等［6］对江苏昆山杏鲍菇生产工厂中染病菇的病原菌鉴定结果基本一致，其认为恶臭假单胞菌P．putida和边缘假单胞菌P．marginalis复合引起杏鲍菇斑点病;也与郭倩等［13］对引起华东及我国南方地区秀珍菇黄菇病病原菌的报道基本一致。

恶臭假单胞菌P．putida在自然界中存在极为广泛［16］，尤其在水、空气和土壤中最多，一旦环境条件适宜即可大量繁殖。如菇料灭菌不彻底、出菇期菌丝和菇料表面长时间暴露在空气中、出菇期用水不安全等，均可使秀珍菇染病。此外，秀珍菇菌丝生长的最适温度为23～27℃，子实体发生的适宜温度为12～30℃，原基形成和分化成菇蕾的最适温度为16～22℃，25℃以上菇蕾成熟加快［17］。而P．putida的生长最适温为30℃左右，在16～22℃生长缓慢(试验数据尚未发表)。所以，在秀珍菇出菇阶段，应将菇房温度控制在16～22℃，切不可为加快菇成熟速度，将菇房温度升高至25℃及以上，否则易引起黄菇病暴发，导致绝产绝收。

图4 基于16S rRNA的5个代表菌株系统发育树Fig．4 Neighbor-joining tree constructed from the 16S rRNA sequences of 5 typical strains of Pseudomonas putida