环状RNA的特征及其在畜禽中的研究进展

徐海冬 冷奇颖 PATRICIA Adu-Asiamah 王章 李婷 张丽

（广东海洋大学农学院，湛江 524088）

环 状 RNA（circular RNA，circRNA） 是 一 类新发现的内源性非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）。与传统的线性RNA（linear RNA）相比，circRNA不存在5'和3'端，为共价键连接在的环状闭锁结构，对RNA外切酶（RNase R）具有抗性，表达稳定，不易降解。近几年研究发现circRNA与人类疾病发生关联紧密，成为RNA领域研究的新热点。早期研究认为circRNA是标准RNA剪接的副产物，但随着研究发现，circRNA在真核生物中普遍存在，认为可能具有一定的生物学功能。circRNA来自RNA前体（pre-RNA）的反式剪接，即下游外显子同上游外显子反向结合形成地环形结构。不同序列来源的circRNA可发挥不同的生物学功能。有报导发现circRNA可吸附miRNA发挥miRNA海绵（miRNA sponges）作用，也有报导发现RNA环化与mRNA形成可竞争剪接因子，以此调控目的基因的表达。但是，circRNA的主要作用还未清晰。本文总结了circRNA的发现历程、特征及分类、环化生成及调控机制、主要功能及在畜禽中的研究进展，并对其在畜禽中的研究进展进行了展望，以期为进一步研究circRNA提供一定的理论依据和技术指导。

1 circRNA的发现历程

circRNA是一类新发现具有环形结构的内源性RNA分子，广泛存在于真核生物体内［1］。如表1，circRNA的发现历程有3个阶段：（1）circRNA真实存在性；（2）真核生物中circRNA的普遍性；（3）某个circRNA的功能性研究。

表1 circRNA发现历程简况表

1976年，Sanger和 Kolakofsky［2-3］在植物类病毒和副流感病毒颗粒中首次发现了circRNA。1979年，Capel等［14］在动物细胞和真菌酵母中发现circRNA，之后也在其他真核细胞中发现了circRNA，如在小 鼠SRY［14］，大鼠细胞色素P4502C24［5］、人的P4502C18中［6］等。但由于circRNA结构的特殊性及当时有限的研究手段，认为circRNA异常拼接产物。近年来高通量测序技术和生物信息学分析技术迅速发展为circRNA的研究提供了契机。2012年，Danan等［7］在古细菌发现circRNA的普遍存在性，并认为其可能具有生物学功能。Salzman等［8］通过RNA-Seq方法在人体中首次鉴定出约80个circRNA，至此circRNA的研究才正式进入人们的视野。

Jeck等［9］在人类的成纤维细胞中检测出超过25 000个circRNA，Memczak等［15］利用高通量测序结合人类白细胞数据库鉴定出1 950种人类circRNAs，1 903种小鼠circRNAs和724种线虫circRNAs，其中人和小鼠中共有81种circRNAs高度保守。随着大量研究表明，circRNA广泛存在真核生物等高等动物体内，并且在基因表达和机体生长发育中发挥重要作用。例如，circFUT10可抑制牛成肌细胞增殖，促进分化［11］；circEIF3J和circPAIP2能促进母基因的线性转录本的表达［12，16］；circZNF609具有编码起始密码子和终止密码子的开放阅读框［17］；circCDR1as和circSry可与AGO蛋白形成沉默复合体抑制翻译起始［10，18］。目前circRNA被认为是一类新的功能大分子，参与基因表达调控，丰富了真核生物转录调控的多样性和复杂性［9，18］。circRNA的发现为研究细胞发育和基因转录调控的分子机制掀开新的一页，对生命活动的探索具有重要意义。

2 circRNA的特征及分类

2.1 circRNA的特点

目前发现，circRNA广泛存在于不同生物体内的各种类型的细胞和组织中。与线性RNA相比，circRNA是没有游离的5'帽子和3'Poly（A）尾巴的闭合环状结构。由于其闭锁的环状结构，circRNA对RNA外切酶RNaseR不敏感［19］，比线性RNA更稳定，不易被降解，大多数circRNA的半衰期超过48 h，而线性 RNA 的平均半衰期只有约 10 h［9，20］，这可能是circRNA可以抵抗分支酶和核酸外切酶RNase R的降解。但大部分circRNA在血清外泌体中并不稳定，半衰期小于15 s［21］，且容易受其他RNA的干扰。癌细胞和癌组织中circRNA较线性转录本低［22］，可能是线性转录本在细胞中易达到合成与降解的平衡，而circRNA更加稳定，在正常增殖的细胞中不断被“积累”，在癌细胞无限增殖过程中被“稀释”。circRNA的长度波动较大，但在大多数真核生物中circRNA具有高度的序列保守性［18，23］。全基因组分析发现来源编码区外显子的circRNA具有高度的序列保守性，但是基因间和内含子来源的circRNA保守性相对较低［18］。

利用一种新的检测工具CIRI explorer2发现了同一基因中一些不保守的外显子只在circRNA中出现，而不存在于线性RNA中。这种只出现在circRNA中的外显子，是因为多个转录本在形成成熟线性RNA时，由于线性RNA的不稳定性而被降解掉，还是因为在形成circRNA时由选择性剪接而特意产生，到目前为止还不清楚。

研究报道发现circRNA在各种生物中表达丰富，其表达水平多数高于母基因的线性转录本［9，15］。而且circRNA表达常具有一定的组织、时序和疾病特异性［15，18］。已知大多数的 circRNA 属于非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）， 但 是 少 数circRNA含有内部核糖体进入序列（Internal ribosome entry site，IRES）可能具有编码能力［24-25］。

2.2 circRNA的分类

circRNA来源于母基因的外显子、内含子、非编码区、反义链转录本或基因间区。根据circRNA序列来源可以分为4大类（表2）［16］：第一类是全部来源外显子的circRNA（Exonic circular RNA，EciRNA）；第二类是全部来源于内含子的circRNA（Intronic circular RNA，ciRNA）第三类是来源于外显子和内含子的circRNA（Exon-intron circular RNA，EIciRNA）；第四类包括来源于反义链转录本的反义circRNA（Antisense circular RNA）、来源于基因间序列或其他未注释基因组序列的circRNA（Intergenic circular RNA）。绝大多数circRNA属于EciRNA，其序列来源于外显子特别是编码区序列。

表2 circRNA 的分类［12，16］

4大类circRNA除了序列来源不同外，还具有以下区别：（1）EciRNA和EIciRNA整个分子均是由3'-5'磷酸二酯键组成，但是ciRNA接合位点（junction）处由 2'-5'磷酸二酯键连接［26］；（2）EciRNA侧翼内含子的长度通常大于内含子的平均长度，并通常含有反向重复序列［9，27］；（3）ciRNA通常包含靠近5'剪接位点的7 nt GU富集碱基序列和靠近分支位点（Branchpoint，BP）的11 nt C富集碱基序列［28］；（4）EciRNA主要存在于细胞质中［8，23］，而 EIciRNA 和 ciRNA 主要存在于细胞核中［26，29］；（5）EciRNA 的序列保守性高于 ciRNA 和基因间circRNA的序列保守性［16］。

3 circRNA的生成和调控机制

真核生物RNA是遗传信息从DNA到蛋白质传递的中间媒介，遗传信息在RNA水平上有着广泛且复杂的调控方式，基因在转录后的pre-RNA要经过复杂的加工才能形成成熟的RNA。单个基因位点可以通过经典可变反向剪接（Alternative backsplicing junctions）及经典可变剪接（Alternative splice junctions）产生多种类型的circRNA［30］，因此不同来源的circRNA的生成机制也不同。

3.1 EciRNA的生成机制

EciRNA是初级转录产物经过特殊的反向剪接反应（Back-splicing）形成的，是下游外显子序列5'剪接位点（5' splice site，5'SS）与上游外显子3'剪接位点（3'splice site，3'SS）反向连接生成了circRNA（图1）。目前有两种模型解释了EciRNA反向剪接形成机制：（1）依赖于剪接体的套索驱动环化模型（外显子跳跃）（Lariat-driven circularization）（图 1-B）；（2）内含子配对驱动环化模型（Intron-pairing-driven circularization）（图 1-C）。

套索驱动环化是由pre-mRNA在剪接过程中部分RNA发生折叠，拉近了非相邻外显子距离，发生外显子跳跃（Exon skipping）的经典剪接（图1-B）。被跳过外显子的上游剪接受体（Splice acceptor，SA）和下游剪接供体（Splice donor，SD）共价结合形成包含外显子的套索前体（Exon-containing lariat precursor），该前体通过内部剪接去除内含子，形成EciRNA［31］。某些个circRNA中存在线性mRNA缺失的外显子，保护了这些外显子不被降解掉，这说明外显子跳跃是形成circRNA的合理机制［8-9］。许多EciRNA侧翼连接点有规范的剪接信号［9-10］，经典的剪接位点决定了外显子环化效率［32］，抑制经典剪接体会导致circRNA水平降低［32］，这些都表明经典的剪接体机制是circRNA生成所必需的。酵母中大多数的circRNA都是由外显子套索前体产生［33］。

内含子驱动环化是位于侧翼内含子区域反向互补序列（Flanking intronic regions reverse complementary sequences，RCSs）（如Alu原件等）（图1-C）互补配对，这会诱导下游外显子序列的5'SS反向接近上游外显子3’SS，有效地促进了反向剪接的发生［9］，随后剪接体切除剩余内含子形成环形RNA分子［34］。当内含子没有被完全剪切掉，保留在新生成环状外显子之间，就会形成EIciRNA类型的分子。

“套索驱动”和“内含子配对驱动”的主要区别是先发生经典剪接还是反向剪接［35］。“套索驱动”是先发生经典剪接，产生一个线性RNA和一个包含外显子的内含子套索，随后内含子套索通过反向剪接生成circRNA［36］。“内含子配对驱动”是先发生反向剪接，并直接生成circRNA［9］。哺乳动物中大多数EciRNA是由内含子配对驱动生成的，而低级的真核生物中的EciRNA则是大多由套索驱动生成［33］。

3.2 EciRNA环化调控机制

有研究发现外显子环化与线性剪接竞争剪接因子，进而与线性RNA存在竞争关系，circRNA的环化效率也受到剪接因子的调节［16］，如一些顺式元件（cis-acting splicing regulatory elements）和反式原件（trans-acting splicing elements）（图 1）［16］。

研究发现单个外显子的circRNA（single exon circular RNA）长度通常大于多个外显子的circRNA（Multiple exon circular RNA）的平均长度［8］。Eci-RNA侧翼内含子含有倒置重复序列（如Alu等）（图1-C）［16］，并且通常含有多个重复序列［8］。这些序列存在竞争性配对，调节环化效率并造成可变环化，致使同一个母基因可以形成由不同外显子和内含子组成的多样型circRNA［27-28］。有研究发现只有30-40 nt短侧翼反向重复序列就足以促进环化［8］，但这种侧翼区反向互补重复序列不一定有效诱导外显子环化，大多数的circRNA由短散在核重复序列（Short interspersed nuclear elements，SINEs）驱动形成，这说明内含子配对的稳定性是circRNA生成的必要条件［37］。

RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）可以通过与内含子中一些短的顺式元件结合发挥作用（图1-D），促使下游外显子序列的5'SS反向接近上游外显子的3'SS，形成有利于反向剪接的结构，促进外显子环化［16］。在人和果蝇体内发现剪接因子盲肌蛋白（Muscleblind，MBL/MBNL1）可以结合到来源于第二外显子circMbl的pre-RNA内含子的MBL结合位点，使两个内含子靠近，从而促进circMbl生成［38］。震动蛋白（Quaking，QKI）能特异识别NA-CUAAY核心（core）及UAAY半位点（half-site）［39］，牵拉结合点相互缩小空间距离，在人类上皮细胞-间质细胞转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的过程中诱导 EciRNA 生成［16］。脂肪瘤融合蛋白（Fused in sarcoma/Translocated in liposarcoma，FUS/TLS）可结合到内含子侧翼区，调控circRNA的形成［40］。有报道称提高RNA聚合酶II转录延伸率（RNA-Pol II transcription elongation rate）可以增加初始circRNA的表达水平［41］。

图1 circRNA的生成示意图［16］

有报道发现RNA编辑酶腺苷脱氢酶（Adenosine deaminase，ADAR）可以结合RNA双链，通过将腺苷酸转变成肌苷酸（A变成I）（图1-E）。环化外显子侧翼区重复序列的双链产生U：I错配，使RNA双链结合能力减弱［34］。ADAR高表达会损伤mRNA前体环状配对序列，减少circRNA的生成［16］。在人和线虫中发现，ADAR的缺失造成circRNA的表达水平异常上升［34］。

EciRNA的生成是多个顺反调控原件共同调节的结果。例如，Laccase基因的环化受到内含子重复序列和RNA结合蛋白的调控［42］，ADAR也会减弱RNA的内含子配对，控制circRNA的生成。

3.3 ciRNA的生成机制

ciRNA是由含有特殊序列内含子在剪接过程中逃避脱支酶（Debranching enzyme，DBE）消化形成的circRNA［12］。这类内含子在3'SS端的分支位点（BP）附近含有11 nt C富集序列，在5'SS附近含有7 nt GU富集序列（图2），这些序列形成的特殊结构会阻止脱支酶与之结合［16，28］。

剪接过程中两个原件结合先形成包含外显子和内含子的套锁中间体（Lariat），再在脱支酶和核酸酶作用下形成ciRNA。其过程包括两次转酯反应（图2）：首先分支位点（Branchpoint，BP）的2'-OH攻击外显子5'SS，形成内含子套索结构，而后5'外显子的3'-OH攻击下游外显子3'SS，释放线性内含子并将外显子顺序连接，最后线性内含子释放3'尾巴后形成2'-5'连接的内含子来源的circRNA。正常内含子套索则是在脱支酶作用下被解开，再被核酸外切酶消化，而含有11 nt C和7 nt GU特殊序列的内含子套索会限制脱支酶与之结合，残余的部分线性RNA序列会被核酸外切酶降解［12］。不同于EciRNA，ciRNA对RNA脱支酶不敏感，并含有2'-5'接合点（Junction）［26］。ciRNA和 EIciRNA 主要存在于细胞核中调控基因表达［16］。

也有研究发现前体tRNA能剪切成环形成tricRNA（tRNA intronic circRNA）［43］，tRNA 剪接内切酶复合体通过识别前体tRNA内特殊的膨胀-螺旋-膨胀（BHB）的结构序列，切除反密码子环中的内含子［38］，此部分内含子两端相连接形成tricRNAs［44］。有研究报道，在白血病患者中的PML/RARα基因上发现，了2个因染色体异位融合的 circRNA（fusion circRNA，f-circRNA）［45］。因此，circRNA的生源机制有待进一步探索明确。

4 circRNA的功能

circRNA广泛存在于各个物种中，大多数真核生物的circRNA具有序列保守性，表达呈现一定的组织特异性和发育阶段性，这表明circRNA是一种功能分子。有报道发现circRNA具有调控基因转录、调控蛋白质翻译、吸附miRNA等功能，也有报道发现一些circRNA具有编码多肽的能力（图3）。

图2 ciRNA的生成机制［12］

4.1 circRNA可调控基因转录

图3 circRNA功能示意图［46］

CircRNA可与转录因子结合调控基因转录（图3-B）。EciRNA可以与细胞内某些蛋白质分子特异性结合，作为脚手架（Scaffold）与RNA或DNA结合，为RBP、RNA、DNA之间互作提供平台。这些转录因子包括 RNA 聚合酶 II、Quaking（QKI）［16］、EIF4A3［47］和 MBL［38］等。例如，circMbl上含有MBL 结合位点［32］，而 MBL 会促进circMbl和MblmRNA的生成。因此circMbl作为自我调节分子会减少circMbl和MblmRNA的合成［48］，提高果蝇和人细胞内线性剪接水平，会使circRNA的生成量明显减少［49-50］。细胞核中位于转录位点附近的内含子锚蛋白重复结构域52（ci-ankyrin repeat domain 52，ci-ankrd 52）和内含子沉默信息调节因子7（Silent information regulator 7，ci-sirt 7）［26］， 可 联 合 RNA聚合酶II复合体，顺式调节母基因的线性转录本表达。circEIF3J和circPAIP2会与U1小核核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）相互作用于基因转录起始位点上游300 bp处，顺式方式调控母基因线性转录本的转录［12，16］。circRNA还可以通过与线性转录本竞争剪接的方式调控母基因的表达。线性剪接与反向剪接的竞争决定了circRNA和母基因线性转录本的表达水平。来源于小鼠甲酸精基因（Formin，Fmn）的circFmn包含了转录起始位点，遗留了一个非编码的线性转录物，因此circFmn可作为mRNA陷阱（mRNA trap）隔离转录起始位点，降低Fmn蛋白的表达水平［51］。

4.2 circRNA与蛋白质相互作用

也有报导circRNA与RBP结合能发挥生物学功能（图3-D）。circCDR1as和circSry可与miRNA的效应因子AGO相结合，形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）［10，18］，占据了mRNA的翻译起始位点，抑制翻译起始。CircANRIL可与pre-rRNA竞争性结合PES1蛋白，抑制核酸外切酶对结合PES1蛋白后的pre-rRNAs加工过程［52］，表明circANRIL影响核糖体成熟，阻碍蛋白质翻译，进而导致细胞凋亡。circFOXO3与细胞周期依赖性激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CD-K2）、P21形 成circFOXO3-CDK2-P21三 元 复合物抑制细胞周期［53］。CDK2与细胞周期蛋白E（Cyclin E）结合形成cyclin E-CDK2复合物，促进细胞G1期向S期过度；CDK2也可与细胞周期蛋白A（Cyclin A）结合形成cyclin A-CDK2复合物，促使细胞完成S期。P21结合CDK2可抑制CDK2与cyclin A、cyclin E的结合，circFOXO3-CDK2-P21三元复合物增强了P21对CDK2的抑制作用，避免了cyclin E-CDK2复合物的形成，阻断细胞从G1期进入S期，同时也避免了cyclin A-CDK2复合物的形成，使细胞停滞在S期或发生凋亡。circFOXO3在细胞质中还可以与抗衰老相关蛋白分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、E2F1 转录因子（E2F transcription factor 1，E2F1）以及抗应激黏着斑激酶（Facal adhesion-associated protein kinase，FAK）、HIF1α结合，阻碍这些蛋白进入细胞核或线粒体，从而促进心肌细胞衰老［54］。

4.3 circRNA作为miRNA海绵

MicroRNA（miRNA） 是 一 种 大 约 22 nt的ncRNA分子，通过与目的基因mRNA的3’UTR结合降低目的基因的表达水平。circRNA含有大量的miRNA应答原件（miRNA response elements，MREs），可吸附miRNA（图3-A），发挥miRNA海绵功能，降低miRNA对其靶基因的抑制作用。由此可见circRNA可作为竞争性内源RNA（Competing endogenous，ceRNA）在转录后水平调控靶基因的表达［16］。例如，来源于小脑退行性相关蛋白1反义转录本（Cerebellar degeneration-related 1 antisense transcript，CDR1as）的circRNA 具有 70个 miR-7结合位点，可调控胰岛素受体底物1（Insulin receptor substrate-1，IRS-1）等多个靶基因的表达［18］。有研究表明miR-671与CDR1as结合后会使得CDR1as裂解，并可释放与之结合的miR-7［55］。阿格蛋白（Argonature，AGO）可与CDR1as结合，使CDR1as免于降解及结合miR-7。circHIPK3可结合miR-124-3p和miR-338-3p调控β细胞Slc2a2、Akt1、Mtpn等关键基因表达［56］。来源于Y染色体性别决定基因（Sex-determining region Y，SRY）的circSry具有16个miR-138结合位点，可吸附miR-138调节肿瘤的侵袭、发展和转移［55，57］。circFUT10可以结合 miR-133a进而抑制牛成肌细胞增值、促进分化［11］；circMTO1可以吸附miR-9抑制人肝癌细胞增值性和侵染性［58］；circZFR可吸附miR-130a和miR-107抑制人胃癌细胞增殖和促进凋亡［59］；circRBFOX2s可吸附miR-206促进鸡成肌细胞增殖［60-61］。对比lncRNA等线性miRNA海绵分子，circRNA不易被RNA外切酶降解，具有较高的稳定性和时效性［16，58］。一些研究表明哺乳动物中的circRNA很少包含大于10个以上的miRNA结合位点，这可能与circRNA本身的稳定性有关［36］

4.4 circRNA可翻译功能蛋白质

有些circRNA含有可编码多肽。目前报道的circRNA翻译机制有两种：（1）依赖内部核糖体嵌入位点（Internal ribosomal entry site，IRES）（图3-C）；（2）依赖 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）甲基化修饰。人circSHPRH可利用重叠密码子翻译功能蛋白质抑制胶质瘤生成［13］。丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus，HDV）核心的负链circRNA可编码122个氨基酸的HDV抗原（Hepatitis D virus antigen，HDAg）［62］。 人circ-FBXW7也 含 有 IRES，可编码21 kD的蛋白质，抑制U251和U373癌细胞的增殖［63］。部分circRNA虽无IRES，仍能结合核糖体启动翻译。如在人和小鼠的成肌细胞中发现具有开放阅读框（Open reading frame，ORF）［17］的circZNF609可翻译蛋白质。Pamudurti等［64］在果蝇大脑组织中通过核糖体印迹鉴定出circMBL的终止密码子处有核糖体结合，并通过蛋白质谱分析得到了circRNA翻译的蛋白质。研究发现m6A甲基化修饰会促进circRNA的翻译［17］，皆因此类circRNA起始密码子上含有RRACH（R=G或A；H=A、C或U），该序列中的A碱基可被甲基化酶复合体METTL3/14甲基化，促使YTHDF3可之结合，并招募eIF4G2和其他翻译起始因子，启动circRNA的翻译［17］。此cricRNA没有终止密码子，若翻译起始，circRNA的环状结构可使核糖体通过类似滚环扩增（Rolling circle ampli fi cation，RCA）的机制参与多肽延长。

4.5 circRNA参与细胞通讯和信号转导

也有报道circRNA可调控细胞通讯和信号转导。血清等外泌体的circRNA与胞质中存在显著差异，表明circRNA进入外泌体是一个选择性过程，可能作为细胞间物质传递、信息交流的途径［29］。分泌小泡（含外泌体）中circRNA比线性RNA比例较高［65］，表明分泌小泡是细胞选择性释放和清除内源性circRNA的一种机制。CircRNA也可调节mRNA的稳定性，例如mcircRasGEF1B可调控脂多糖（LPS）诱导的细胞间黏附因子（ICAM-1）mRNA的稳定性，敲低mcircRasGEF1B会影响LPS诱导的ICAM-1的表达［66］。

综上所述，circRNA是一类新发现的分子，具有不同的分子特点和形成机制，关于其功能研究还有待深入。circRNA在物种中具有较高的序列保守性，具有调控机体生长发育和新陈代谢的功能，在遗传品种改良和品系选育的工作中，有望作为分子育种的新靶点。

5 circRNA在畜禽中的研究进展

畜禽的经济性状与疾病防控是动物科学关注的重点。近年来，circRNA在该领域的研究也是如火如荼，为挖掘农业动物重要经济性状遗传机制和调控网络提供了新思路。

5.1 circRNA在家畜中的研究进展

家畜繁殖机能、生长发育、肌肉发育、脂肪沉积、产毛（绒）量、产奶量和疾病发生等是畜牧业关注的重要经济性状。研究发现，circRNA参与家畜大脑、卵巢、肌肉、脂肪、心脏、肝脏和乳腺等性状的发育和疾病发生过程。

在肌肉和脂肪发育方面，Liang等［67］从贵州小型猪脂肪、心肌等9种不同组织及3个发育阶段的骨骼肌中鉴定出了5 934个circRNA，绘制了猪circRNA的时空表达谱，确定了149个与肌肉生长发育、肌肉收缩、染色质修饰、阳离子平衡、ATP水解耦合的阳离子转运、细胞紧密连接及钙离子信号通路有关的circRNA。并构建了首个小型猪的circRNA数据库。Chen等［68］采集180 d和8年雅南母猪的心肌和背最长肌，通过RNA-seq发现了心肌样本中26个mRNA、4个lncRNA、22个miRNA和26个circRNA差异表达；骨骼肌样本中81个 mRNA、5个 lncRNA、79个 miRNA和 62个circRNA差异表达，由此可见心肌和骨骼肌的衰老过程中存在差异。在肌肉老化过程中，Chen等［68］还评估了多重共调控关系，构建了circRNA-miRNA-mRNA共表达网络，为研究肌肉老化的分子机制提供了良好的基础。Sun等［69］研究蓝塘猪和长白猪肌肉组织中差异表达的编码基因、lncRNA、circRNA及miRNA，结果在蓝塘猪中发现有1 401个circRNA高表达，2 959个circRNA低表达，其中有236个是与肌肉发育相关的，并发现有40个circRNA参与miRNA介导的ceRNA调控网络。

Li等［70］利用RNA-Seq方法研究胚胎期和成年期哈萨克羊背最长肌组织中的circRNA，共鉴定出6 113个circRNA，功能分析发现circRNA的母基因主要富集在肌肉生长和发育相关的信号通路，oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和 oar_circ_0001099具有肌肉发育相关miRNA的多重保守位点。Wei等［71］分析胚胎期和成年期秦川牛的背最长肌中差异表达的circRNA，共鉴定出12 981个circRNA，其中有624个在成年牛中高表达，204个低表达。典型的是circLMO7，过表达circLMO7会吸附miR-378a-3p抑制成肌细胞分化，使得细胞周期中S期细胞数量增加，G0/G1期细胞数量减少，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。同课题组Li等［11］发现circFUT10可以结合miR-133a促进成肌细胞分化，使得细胞周期中G0/G1期细胞数量增加，S期细胞数量减少，抑制细胞增值，促进细胞凋亡。Li等［72］发现circFGFR4可以吸附miR-107，促进Wnt3a基因表达，进而促进成肌细胞分化诱导细胞凋亡，对细胞增殖没有显著影响。

在大脑和生殖系统研究方面，VenØ等［73］对猪胚胎发育期大脑组织测序共发现4 634个circRNA具有时间表达差异，皮质部circRNA的表达丰度最高，这表明circRNA对于猪胚胎期脑部发育具有重要调控作用。Li等［74］利用RNA-seq研究产前、产后哈萨克羊脑垂体中差异表达的circRNA发现，大量的circRNA参与垂体激素分泌及相关通路，oar_circ_0000059具有58个与垂体相关的miRNA结合位点，并且40个circRNA包含至少1个IREs和ORF，这表明circRNA广泛参与垂体的发育和分泌功能。Tao等［75］通过麻城黑山羊和波尔山羊排卵前后卵泡组织RNA-seq分析，共检测出1 395个circRNA，其中有37个差异表达。GO和KEGG分析发现大量circRNA参与卵巢类固醇生成和P53信号通路。其中chi_circ_0008219可与3个卵泡相关的miRNA相结合，表明circRNA对母羊卵巢卵泡有潜在影响。

在泌乳性能研究方面，Zhang等［76］研究产后90 d和250 d荷斯坦奶牛乳腺组织中差异表达的circRNA，共鉴定出6 621个circRNA，其中有2 231个共表达。功能富集分析发现来源于4个酪蛋白 编 码 基 因（CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3）的circRNA在90 d奶牛乳腺组织中高表达，这些circRNA也具有miR-2284的结合位点，而miR-2284可与CSN1S1和CSN2的mRNA结合，由此猜测这些circRNA可能参与酪蛋白的表达调控。Zhu等［77］对分娩后1、7和21 d大鼠的乳腺组织高通量测序，发现并鉴定了来源于Tc2n基因Exon10和Exon11的circRNA（cTc2n）。定量检测发现cTc2n在乳腺中高表达。cTc2n在这三个时间点的表达变化呈现先显著下降、后轻微上升的趋势，而Tc2nmRNA呈现相反的趋势。生信分析发现cTc2n不存在miRNA结合位点，而Exon10和Exon11编码Tc2n蛋白的保守区域，推测cTc2n可抑制Tc2nmRNA的产生。

在动物疾病发生研究方面，小鼠作为畜牧学科研究的模式动物，在家畜研究中应用广泛，尤其是在疾病研究方面。Pei等［78］通过将小鼠暴露在氡辐射的条件中，通过对肺组织RNA-aeq发现107个circRNA上调，83个circRNA下调，其中30个高表达的circRNA具有多个miRNA结合位点，表明circRNA可能参与氡诱发的肺损伤的病理变化。Huang等［79］对水迷宫测试后的5月龄、10月龄SAMP8鼠和SAMR1鼠的海马体RNA-seq，发现mmu_circRNA_017963与自噬体组合、胞外分泌、细胞凋亡、RNA剪接、突触囊泡循环等多个过程，表明circRNA参与阿兹海默症的发生。Errichelli等［40］通过体外培养老鼠和人的胚胎干细胞，改变RNA结合蛋白FUS的表达水平，检测circRNA的变化，发现FUS可结合到侧翼内含子区，调节circRNA的形成。关于人肿瘤研究中，活体实验常在小鼠皮下异体移植人癌变的肿瘤，再通过注射过表达载体或干扰片段来改变特定circRNA的表达，研究发现circRPKCI［80］、circ-Amotl1［81］、circCDYL［82］、circHIPK3［83-84］、hsa_circ_0007385［85］、hsa_circ_00126-73［86］、circCCDC66［87］和 circRNA_100782 等 circRNA 分子可促进肿瘤生长，circ-FBXW7［63］、circ-ITCH［88］、circC3P1［89］、circFoxo3［90］和cirZKSCAN1［91］等circRNA分子可抑制肿瘤生成。

5.2 circRNA在家禽中的研究进展

在家禽的研究中，circRNA在生长发育、肌肉发育、产蛋量和疾病防治中的作用是人们主要关注的内容。

Ouyang等［60-61］采 集 11胚 龄（E11）、16胚龄（E16）、1日龄（P1）杏花鸡母鸡的腿肌，通过RNA-seq共鉴定出13 377个circRNA，其中有1 470个差异表达，有946个circRNA具有一个或多个miRNA结合位点，共涉及150个已知miRNA分子。进一步分析发现鸡circRBFOX2.2-3和circRBFOX2.2-4可吸附miR-206，促进鸡成肌细胞增殖，抑制成肌细胞分化，鸡circSVIL.6-14可结合miR-203，促进成肌细胞增殖和分化［12，92］。利用iTRAQ技术鉴定出差异表达蛋白，并与circRNA的数据联合分析，结果在E11 和 P1比较组发现23个差异蛋白基因具有差异表达的circRNA。包括肌肉收缩通路相关的基因DMD、TNNT3、TNN、TPM1、TPM2和TPM3，其中DMD和TNN基因含有多个差异的circRNA［60］。由此可见，在鸡胚胎期肌肉发育过程中，circRNA通过吸附miRNA或参与调控蛋白表达等方式调控肌肉发育。

此外，Zhang等［93］用鸡禽白血病 J（ALV-J）亚型侵染ALV抗性和ALV敏感性鸡，20周后采集肝脏组织。RNA-seq鉴定出1 800多个circRNA，其中有32个circRNA差异表达。且发现在ALV抗性组中的12个circRNA存在多个miRNA分子结合位点，基因功能富集分析发现主要集中于免疫通路。这表明circRNA可能参与ALV-J引起的免疫过程。

6 展望

目前对于circRNA的研究仍处于起步阶段，有大量技术问题需要突破。随着高通量测序和生物信息学的快速发展，将会有越来越多的circRNA被发现，其功能研究会越来越深入。circBase［94］、Circ2Traits［95］、CircNet［96］等数据库中收录了近 10万circRNA测序结果，并能预测circRNA-miRNA-mRNA相互作用。circRNA过表达载体和干扰手段不断趋于成熟，使人工调控细胞内circRNA的表达成为可能，利于进一步探索circRNA的功能［18，97］。CircRNA与疾病发生密切相关，可作为癌症等疾病监测的新型靶标分子［58］。在畜禽研究方面，主要集中在生长发育、肌肉发育等经济性状相关的circRNA的研究。对于circRNA的功能注释仅限于circRNA的来源编码基因或可能的miRNA结合位点进行预测分析，因此需进一步探索circRNA作用网络，研究circRNA在基因表达调控的作用，加深畜禽的经济性状相关circRNA的筛选与鉴定，更好的为畜禽分子育种提供理论依据和技术指导。