不同病程阿尔茨海默病患者尿液中AD7c-NTP含量的研究*

郭晓聪 ，徐晓娅，黄琳明，殷明刚

1. 四川省自贡市第一人民医院检验科(自贡643000)，2. 四川省自贡市第一人民医院神经内科(自贡643000)

主题词 阿尔茨海默病/诊断 @阿尔茨海默病相关神经丝蛋白 认知功能障碍 遗忘

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是痴呆的最常见的原因,按其病程可分为轻度、中度、重度痴呆阶段。而轻度认知障碍(Mild congnitive impairment,MCI)是AD的早期阶段，如果在此阶段不加干预，其每年向AD发展的几率达到10%～15%[1]。AD的核心的病理特征为β-淀粉样蛋白的沉积和神经元纤维缠结。常见生物标记物为脑脊液中的Aβ，和Tau蛋白，但因其需要取脑脊液标本，具有创伤性，患者接受性较差。近年来有研究表明[2-3]，阿尔茨海默病相关神经丝蛋白( AD7c-NTP)在阿尔茨海默病患者脑脊液及尿液中均呈高表达状态;而尿液中AD7c-NTP的检测，因其具体无创性，故成为理想的生物标志物。但目前其在AD中的诊断价值，尤其在aMCI阶段的表达情况，以及在不同AD阶段中的表达变化尚无定论。因此，本研究通过测定不同阶段AD患者尿中AD7c-NTP的水平,以探讨其在AD辅助诊断中的价值。

资料与方法

1 一般资料 选取我院2016年1月至2017年12月记忆门诊及神经内科住院部收治的68例AD患者，及根据其CDR评分，分为轻度AD组(36例)及中重度AD组(32例)，选取aMCI患者38例为aMCI组，并选取同期智能正常的30名健康志愿者为正常对照组。AD组纳入指标：根据美国国立老化研究院和阿尔茨海默病协会于2011年修订的 AD 诊断标准(即NIA-AA诊断标准)考虑诊断为很可能的AD痴呆[4]；经神经心理学检测：MMSE 量表：中学及其以上文化者≤24分，小学文化者≤ 20 分，文盲者≤ 17 分；ADL的评分≥25分；临床痴呆评定量表(CDR) 评分≥1 分；汉密尔顿抑郁量表(HAMD) 评分≤7 分；Hachinski 缺血指数量表(HIS) 评分≤4分。半年内头颅 MRI影像学诊断提示为非其他原因导致痴呆。并根据CDR的评分，将CDR=1分者纳入轻度AD组，将CDR=2分及3分者纳入中重度痴呆组。aMCI组纳入标准：参照修订版Petersen诊断标准：①通过患者本人或知情者报告，或经有经验的医师发现患者存在认知损害；②经客观量表证实，存在一个或多个认知领域损害的证据；但患者保持独立的日常生活能力，复杂的工具性日常生活能力可能存在轻微损害；③未达到痴呆诊断标准。④MMSE的评分范围在24～30分，ADL<25分，CDR=0.5分。本研究选择MCI分型中遗忘型单认知或多认知领域损害者(aMCI)。排除标准：①患有其他可致认知功能减退的神经系统疾病者：如帕金森病、颅内肿瘤、血管性痴呆以、正常颅压脑积水、路易体痴呆等；②患有可导致痴呆的系统性疾病者：如酒精中毒性脑病、HIV感染、神经梅毒、维生素B12缺乏、甲状腺功能减退等；③药物、毒物所致的痴呆；④瞻望状态；⑤其他精神障碍所致(如抑郁、精神分裂症)。

2 尿AD7c-NTP的测定 各组受试者均于清晨留取中段尿10 ml，采用广州汉光医药进出口有限公司提供的尿液AD7c-NTP检测试剂盒，将采集的合格尿液标本于1700×g离心10 min，取上清液，置2 ml EP管，于-80 ℃密封保存备用，上述步骤于 2 h 内完成。严格按照试剂盒说明书进行操作，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)，BIO-RAD Model 680酶标仪(美国Bio-Rad公司)450 nm 波长处测定吸光度(OD)值，获得尿液AD7c-NTP表达水平。出现下列任意一种情况即为不合格标本：①尿蛋白阳性;②在尿液白细胞以及红细胞的计数上存在异常，还会有细菌滋生的现象;③pH值异常(5.40 ～8.40);④尿比重异常(1.00～1.03);⑤在患者尿液中含有少许结晶;⑥尿糖、尿酮体、尿硝酸盐、尿胆红素或尿胆原呈阳性。

结 果

1 不同组别受试者一般资料的比较 四组受试者在性别、年龄、受教育年限方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2 不同组别受试者MMSE及MoCA评分比较 见表1。

表1 各组受试者MMSE及MoCA评分比较分)

注：与正常对照组比较，▲P<0.05，▼P<0.01；与aMCI组比较，☆P<0.05，★P<0.01；与轻度AD组比较，◇P<0.05，◆P<0.01

3 各组受试者尿AD7c-NTP含量比较 见表2。

表2 各组受试者尿AD7c-NTP含量的比较

注：与正常对照组比较，▲P<0.05，▼P<0.01；与aMCI组比较，☆P<0.05，★P<0.01；与轻度AD组比较，◇P<0.05，◆P<0.01

讨 论

2011年美国国立老化研究院和阿尔茨海默病协会修订了AD的诊断标准，即 NIA-AA诊断标准[4]，该标准强调了AD诊断的连续性，故生物标志物在其诊断中具有重要的作用，尤其是痴呆前的MCI阶段。目前比较公认的生物标志物为脑组织或脑脊液中的Aβ、Tau 蛋白，经PET或抽取脑脊液进行检测。因上述标志物的检查其价格昂贵、标本采集困难等原因，故难以在临床进行广泛开展。

AD7c-NTP是一个相对分子质量约为 41KD 的跨膜磷蛋白，在神经元胞体中表达，在 AD 脑组织中选择性增高，与神经炎症和细胞凋亡密切相关[5]。相关研究发现， AD患者的脑组织、脑脊液和尿液中AD7c-NTP分子含量均有增加，其对AD早期诊断具有较高的敏感性和特异性[6]。另有研究表明，MCI阶段的患者脑脊液及尿液中 AD7c-NTP 的含量也有所升高[7]。同时也有研究表明，尿AD7c-NTP 的含量与痴呆的严重程度相关[8]。因尿液标本相对易于获取，故尿AD7c-NTP可能成为AD的新的理想的标志物。Goodman等[9]通过对AD 患者和非 AD 患者尿样中 AD7c-NTP 的含量进行对比研究发现，AD 组患者尿 AD7c-NTP的含量显著高于非AD痴呆组及正常对照组。在MCI方面，Chen Y等[10]通过分析52例MCI患者和33例正常对照组受试者进行尿AD7c-NTP 含量的测定并分析，提示当尿AD7c-NTP 含量为 268.57 ng/L 时，对应的灵敏度和特异度分别为 83.3% 和 90.0%，其和最大。Zhang N等[11]通过对22例轻中度AD及8例MCI进行研究，且所有患者均进行了PIB-PET检查和尿AD7c-NTP 含量的测定，结果提示，以尿AD7c-NTP 含量1.46ng/ml为分界值，68.8%的PIB-PET显示的Aβ阳性者尿AD7c-NTP 含量增高，而92.9%Aβ阴性者尿AD7c-NTP 含量正常，提示其在评估AD和MCI患者的Aβ沉积方面具有高度的特异性和中度的敏感性。以上研究均提示，尿AD7c-NTP 的含量的测定在AD及MCI中具有较高的特异度和灵敏度。

本研究对aMCI组患者以及轻度、中重度AD患者进行神经心理量表的测定，提示随着病情的加重，其MMSE及MoCA评分逐渐减低。进一步对几组受试者进行尿液AD7c-NTP的测定，结果显示：三组患者尿液AD7c-NTP含量分别为(1.87±0.78)ng/ml、(2.25±0.27)ng/ml、(3.42±0.35)ng/ml，与正常对照组比较，差异具有统计学意义；与aMCI组比较，轻度及中重度AD组尿AD7c-NTP含量增加，差异有统计学意义；轻度AD组与中重度AD组比较，中重度AD组尿AD7c-NTP存在较高的含量。提示不同病情程度的AD患者，尿液中AD7c-NTP含量均有增高，且增高的程度与痴呆的严重程度具有相关性。尿液中AD7c-NTP含量的检测有望作为AD患者辅助诊断的生物学指标。

此次研究采用尿液AD7c-NTP含量的检测最大的优势在于无创，容易被患者接受；但此检测对尿液标本的要求较高，对于合并较多基础疾病(如肾功能不全)的患者不适用；且对检测的技术要求较高。本研究尚存在一定局限性，ELISA 试剂盒存在一定缺陷，如影响抗原抗体反应的因素较多,且常可出现板间变化；另外，这次研究没有进行ELISA 复孔试验环节，故可能导致假阳性增高；同时，因本研究纳入的样本量偏小，故尿液AD7c-NTP分子的含量是否和 AD 病程相关，尚需我们进一步扩大样本、提高检测技术进行更为深入的研究。