丹红注射液对动脉粥样硬化兔主动脉血红素氧合酶-1表达的影响研究*

郭向东，陈海潮 ，杨 征，杨 光∆

1.陕西省人民医院心血管内二科(西安 710068),2. 陕西省咸阳市三原县医院(三原712000)

主题词 动脉粥样硬化/病理生理学 血红素氧合酶-1/代谢 @丹红注射液 兔

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)特征性病理变化为动脉内膜增厚、变硬，动脉壁弹性减低及粥样斑块形成[1]。血红素氧合酶-1(Hemo oxygenase-1，HO-1)是热休克蛋白家族成员之一，广泛存在于肝、脾及网状内皮系统和骨髓等组织。氧化应激、重金属、感染、缺血再灌注及其底物血红素均可诱导HO-1的表达[2-3]。丹红注射液主要组分为传统中药材丹参、红花的有效成分，具有通经舒络、活血化淤的功效，动物实验证实其可延缓、抑制动脉粥样硬化的发生、发展。本研究选择36只AS易感动物，遗传性高脂血症(Watanabe heritable hyperlipidemic，WHHL)兔为研究对象，建立兔动脉粥样硬化模型，观察丹红注射对兔动脉粥样硬化斑块内HO-1表达的影响，探讨其抗动脉粥样硬化的可能机制，为此类药物用于人类动脉粥样硬化防治疗提供理论依据。

材料与方法

1 实验动物、药品及试剂 选择西安交通大学实验动物中心提供的1月龄健康雄性WHHL兔36只，体重(1.4±0.4)kg。普通饲料适应性喂养1周后，将WHHL兔随机分为三组各12只：对照组(A组)、高胆固醇饮食组(B组)及疏血通注射液组加高胆固醇饮食组(C组)。A组饲喂正常饲料(120g/d)；B组予以饲喂高胆固醇饲料(120g/d)；C组予以高胆固醇饲料(120g/d)+丹红注射15ml/kg/d腹腔内注射，饲喂12周后将每组WHHL兔处死。试剂盒、缓冲液、抗体稀释液及HO-1鼠抗兔多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。光学显微镜、病理图文分析系统、PCR仪及Gel Doc100 成像系统均有教育部西安交通大学心血管离子通道疾病重点实验室提供。

2 研究方法

2.1 模型建立:实验动物给予耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠30mg/kg全身麻醉后处死动物，立即开胸分离主动脉，清除血管外组织，生理盐水冲洗，中性甲醛缓冲液中固定。

2.2 主动脉血管内皮HO-1表达水平的测定：采用免疫组织化学染色法测定三组主动脉血管内皮HO-1表达水平。结果判定：HO-1阳性表达为细胞胞浆中有棕黄色颗粒，随机选取4个视野，200倍镜下观察，图象分析采用病理组织实时摄像显微镜系统摄像，并使用图像分析软件分析阳性面积百分比。

2.3 Western Blot技术测定主动脉血管组织中HO-1蛋白的表达量，提取主动脉血管组织总蛋白，BCA试剂盒测蛋白总浓度，绘出标准曲线，计算出样品实际浓度(μg/μl)。80mV电压，100g/L SDS-PAGE凝胶电泳2h； 250mA转膜70min；50g/L脱脂奶粉封闭液，室温下封闭2h；TBST洗膜3次。加入HO-1(1∶500比例稀释)、β-actin(1∶5000比例稀释)一抗，4℃孵育过夜；洗膜3次后加入二抗(1∶5000比例稀释)室温下孵育2h；TBST洗膜，10min ，3次；置强化学发光试剂ECL底物中化学反应5min；暗室曝光显示特异的蛋白信号。Gel Doc100 成像系统进行图像处理，记录结果。目的条带与内参(β-actin)条带吸光面积积分的比值分析目的蛋白。

结 果

1 三组主动脉动脉粥样硬化程度比较 C组AS斑块面积与动脉内膜面积比值、内膜厚度、内膜/中膜厚度比均分别低于B组，而均分别高于A组，差异有统计学意义(P均<0.05)，见表1。

表1 各组斑块面积百分比比较各组内膜厚度、内膜/中膜厚度比

注：与A组比较，*P<0.01；与B组比较，∆P<0.05

2 三组HO-1特异性染色表达阳性面积比较 A组、B组和C组血管壁HO-1表达分别为(15.71±3.52)%、(38.49±8.86)%、(26.45±3.92)%。经比较后发现，C组HO-1表达高于A组而低于B组，组间比较差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

3 三组间动脉壁及AS斑块组织HO-1蛋白表达比较 采用Western Blot技术测定三组动脉壁及AS斑块组织HO-1蛋白水平，显示心房组织中HO-1的蛋白相对表达在A、B、C组分别为(0.452±0.073)、(1.657±0.297)、(1.082±0.263)。经统计学处理后提示C组HO-1蛋白的表达高于A组而低于B组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

A:正常对照; B:高脂饮食组; C:高胆固醇饮食加丹红注射

图2 三组间HO-1蛋白的表达

HO-1是一种应激性反应蛋白，其通过抗氧化应激、抗细胞增殖、抗凋亡、抑制血小板聚集及炎症损伤、调节血管壁的紧张性和参加细胞内信号的传递等机制对心血管系统起着保护的作用[4]。已有研究证实，冠心病患者的内皮细胞、动脉粥样硬化斑块内以及平滑肌细胞内HO-1的表达增加[5]，HO-1及HO-l的mRNA在动脉粥样硬化发展的过程中表现出逐渐增加的趋势[6]。HO-1抗动脉粥样硬化机制可归纳为：①HO-1通过讲解游离胆红素、抑制低密度脂蛋白的氧化修饰作用而显著减低血管内皮的氧化应急损伤；②HO-1的代谢产物一氧化碳可抑制血管内皮凋亡、促进内皮增值及损伤血管内皮修复；③HO-1可通过抗炎机制拮抗动脉粥样硬化的发生、发展[7-8]。

丹红注射液的主要成分有丹参素、丹参酮、红花苷、红花黄色素等，为传统中药丹参、红花有效提取物所得复合剂。研究证实：丹红注射液具有降低血脂、抑制血小板聚集、改善内皮功能等作用，从而在临床上广泛用于心、脑血管疾病及外周血管等疾病的治疗[9-10]。相关研究证实：丹红注射液具有逆转内皮损伤、抑制hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎症因子表达的作用[11]。现代医学认为我国某些传统地道中药材的有形成分如多酚化合物、黄酮类物质可通过特殊的细胞信号转导通路上调HO-1表达进而发挥其保护内皮、抗氧化应急等功能[12]。由此可见，HO-1与丹红注射液在拮抗动脉粥样硬化的发生、发展的过程中具有协同作用。

本研究以AS易感动物WHHL兔为研究对象，建立兔动脉粥样硬化模型，应用免疫组织化学法及 Western blot法观察丹红注射液对兔动脉粥样硬化斑块内HO-1表达的影响。实验结果显示：正常新西兰兔进食高胆固醇饲料后，主动脉血管壁HO-1表达阳性面积比明显升高，高胆固醇饮食加丹红注射液组主动脉血管壁HO-1表达阳性面积少于高胆固醇饮食组，这与相关报道一致[13]。究其原因，一方面可能为丹红注射液组减少促炎因子的释放，从而发挥其抗炎作用，进而上调了HO-1的表达；另一方面可能与丹红注射液的降低血脂、抑制血小板聚集、改善内皮功能等作用有关，这进一步证实了丹红注射液可能通过上调HO-1的表达从而发挥起其抗动脉粥样硬化的作用。