复元醒脑汤对糖尿病脑梗死大鼠microRNA-503及CCNE1、CDC25A蛋白表达的影响及对促进血管新生的实验研究*

沈俊逸 方邦江 赵智明 刘春丽 壮雨雯 徐文俊 蔡 辉△

（1.南京军区南京总医院，江苏 南京 210002；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032）

糖尿病引起代谢紊乱并导致毛细血管、大血管的病变，是引发脑梗死的一个独立危险因素［1-2］。与非糖尿病脑梗死患者相比，糖尿病急性脑梗死患者的脑部血管狭窄病变支数更多、程度更严重［3-4］。相关研究发现，糖尿病影响侧支循环的建立，当糖尿病患者血糖水平升高时，体内单核细胞参与的毛细血管或者大血管的形成以及血管重塑的能力显著减弱［5-9］。微小RNAs（microRNAs）在糖尿病及其血管等并发症的发生、发展过程中具有非常重要的作用［10-12］。microRNA-503是microRNA的一个亚型，其调控生物机体内的各种血管，包括动脉、静脉血管以及毛细血管的内壁内皮细胞的生理功能，microRNA-503表达过度时，会导致血管的坏死，抑制血管的新生。而通过上调细胞周期蛋白E1（CCNE1）和 cell division cycle 25 A（CDC25A），在一定程度上能够抑制microRNA-503的表达，从而改善各种血管内皮细胞的功能，避免了其损伤的发生，并且能够帮助微血管网络形成，促进血管新生。因此，micro RNA-503核酸的表达水平对糖尿病相关的血管并发症的治疗具有非常重要的参考价值以及临床意义［13-17］。本研究应用中药复方复元醒脑汤干预糖尿病脑梗死大鼠，观察其对实验大鼠缺血脑组织的血管新生及脑部微循环的影响，以期从microRNA-503调控途径阐释复元醒脑汤起效的具体机制和作用靶点。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

150只健康雄性 SD 大鼠，体质量（250±25）g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物合格证：SCXK（沪）2011-009。

1.2 试药与仪器

复元醒脑汤：人参（另煎）10 g，三七10 g，石菖蒲12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，生南星 15 g，制大黄（后下）9 g。复元醒脑汤生药质量浓度388 g/L，来自南京军区南京总医院药剂科。二甲双胍（西安海欣制药有限公司，规格 1.25 mg/250 mg，国药准字 H20041400），尼莫地平（江苏康缘弘道医药有限公司，规格60 mg，批号H20066423）。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；TTC染色液（2%）购于上海远慕生物科技有限公司；蛋白浓度BCA法测定试剂盒购于美国Thermo公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海市碧云天生物技术有限公司；Actin抗体购于美国Sigma公司；CDC25A抗体购于香港Abcam公司；CCNE1抗体购于美国Millipore公司，引物购于生物工程（上海）股份有限公司。RNA抽提试剂，cDNA反转录试剂盒和Syber Green定量PCR试剂盒购于日本Takara公司。RIPA裂解液，BCA蛋白定量试剂盒和ECL化学发光试剂盒购于上海碧云天生物公司。高脂饲料（蛋白质21%、碳水化合物20%、脂肪59%）和正常饲料（碳水化合物64%、蛋白质23%、脂肪13%）由上海斯莱克实验动物公司生产。

1.3 造模与分组

150只实验大鼠按随机数字表法均分为5组：空白对照组、假手术组、模型组、西药治疗组、中药治疗组，每组30只。空白对照组喂食正常大鼠饲料；假手术组、模型组、西药治疗组和中药治疗组的大鼠先腹腔注射链脲佐菌素（STZ，美国 Sigma 公司）50 mg/kg，随后采用高脂肪食物饲养2周，连续测量1周血糖大于16.6 mmol/L为造模成功。将3/0单股尼龙线，放到肝素钠中浸泡，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉糖尿病模型大鼠，在颈部正中偏右侧进行竖直切口，剥离出右侧颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。结扎ECA起始端和CCA近心端，用眼科剪在CCA远心端和近心端之间剪一个小口距离颈总动脉分叉5 mm，经CCA插入3/0尼龙线至大脑中动脉起始段，深度为（18.5±0.5） mm；维持体温（37.0±0.5） ℃。用乙醚再次麻醉大鼠于术后2 h把尼龙线轻轻拔退1 cm，作为再灌注0 h。空白对照组不做任何处理。假手术组插线深度为10 mm，余同实验组。本实验中动物处理方法符合动物伦理学标准。

1.4 给药方法

完成造模后，中药治疗组灌胃复元醒脑汤10.4g/（kg·d），每日 2次。西药治疗组灌胃二甲双胍 27 mg/（kg·d），每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日 2 次。 空白对照组、假手术组、模型组均灌胃等量的0.9%氯化钠注射液。各组连续灌胃14 d后处死取材。

1.5 标本采集与检测

10%水合氯醛深度麻醉后，快速对实验动物进行断头，迅速剥离颅骨，小心取出脑组织［18］，10%中性固定液固定脑组织48h，然后进行脑组织脱水、石蜡包埋，最后将组织切成5 μm厚的切片。使用免疫荧光染色（VEGF）观察脑部微血管，细胞核用DAPI染色。使用正立微循环观察系统动态观察大鼠鼠脑细静脉中红细胞流速、血管管径、白细胞滚动和黏附、白蛋白漏出等脑部血管微循环的改变。

1.5.1 脑组织 CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表达水平检测 采用Real-Time PCR技术，检测脑组织CDC25A、CCNE1、microRNA-503基因表达水平。具体引物序列如下。microRNA-503 F：TAGCAGCGGGA ACAGTTC。microRNA-503 microRNA-503 R：GTGCA GGGTCCGAGGT。CDC25A F：GGGAATGAGCAGCCTC TTCTTCDC25AR。ATCTCTACAAACCAGACCAGGG；C CNE1F：ACAGCTAGCGCGGTGTAGCCNE1R：GGACTT GGAACTCAGACCCGGAPDHF：ACTTTGGCATCGTGG AAGGGGAPDHF：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。用RNA抽提试剂盒抽提脑组织中的RNA，根据Takara反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，根据Syber Green定量PCR试剂盒说明书将反转录后的cDNA进行定量PCR。PCR条件采用两步法：98℃ 10 s，58℃20 s，40 次循环。

1.5.2 脑组织中的CDC25A、CCNE1蛋白表达水平检测 采用常规的Western blotting实验方法［19］检测脑组织中的CDC25A、CCNE1蛋白表达量。用RIPA裂解液进行组织匀浆，离心后用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，上样30 μg蛋白/孔，进行SDS-PGAE电泳，PVDF转膜，孵育CDC25A和CCNE1抗体，孵育二抗，最后用ECL化学发光试剂盒在Biorad化学发光成像系统中进行免疫印迹检测。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 复元醒脑汤对各组实验大鼠脑部微循环功能的影响

使用正立微循环仪观察复元醒脑汤对脑梗死脑部微循环的作用。空白对照组：红细胞流速较快、血管管径比较粗、白细胞滚动正常且没有黏附，没有白蛋白漏出。假手术组：红细胞流速较慢、血管管径较细、白细胞滚动慢且有白细胞黏附现象，有白蛋白漏出现象。模型组：红细胞流速较慢、血管管径较细、白细胞滚动慢有白细胞黏附现象，有白蛋白漏出现象。西药治疗组：红细胞流速正常、血管管径较粗、白细胞滚动正常，少见白细胞黏附现象，白蛋白漏出现象不明显。中药治疗组：红细胞流速正常、血管管径较粗、白细胞滚动正常，少见白细胞黏附现象，白蛋白漏出现象不明显（图1）。

图1 各组脑血管微循环观察

2.2 复元醒脑汤对脑梗死后缺血脑组织部位血管新生的影响

血管的新生需要多种生长因子，其中血管内皮生长因子（VEGF）是非常重要的一种，这种生长因子能够有效地促进内皮细胞的生长增殖，在血管新生和血管生成的各个阶段发挥着重要作用，VEGF是血管新生的一个重要指标，是血管新生的关键因子。通过对不同组别大鼠脑组织VEGF的免疫荧光实验发现：空白对照组血管数量丰富，管壁比较厚，官腔饱满；假手术组的管壁较薄，管腔比较粗；模型组血管数量少，管腔破损严重；西药治疗组的管壁增厚；中药治疗组的管壁增厚，有一定的血管新生现象，管腔增大。以上数据提示中药治疗组和西药治疗组均对糖尿病脑梗死组织的血管新生有促进要作用，且中药治疗组优于西药治疗组（图2）。对照组血管数量丰富管壁比较厚，官腔饱满；假手术病组管壁较薄，模型组血管数量少官腔破损；西药治疗组的管壁增厚，管腔小；中药治疗组的管壁增厚，管腔增大提示中药治疗组对脑血管的功能恢复有重要作用。

图2 各组脑血管免疫荧光

2.3 复元醒脑汤调控microRNA-503、CCNE1、CDC25A mRNA水平的表达

各组实验大鼠缺血部位脑组织中抽提RNA，做荧光定量检测microRNA-503基因的表达量以及CCNE1、CDC25A基因的表达水平，结果显示：模型组缺血脑组织中microRNA-503表达明显上调；与模型组相比，西药和中药治疗组大鼠缺血脑组织中microRNA-503的基因表达明显降低（P＜0.01），中药治疗组和西药治疗组差异无统计学意义（P＞0.05）；相对于模型组，空白对照组和假手术组的microRNA-503表达量都比较低，空白对照组和假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，中药治疗组和西药治疗组的大鼠缺血脑组织中CCNE1、CDC25A的mRNA表达上调（P＜0.01），从而反向抑制了microRNA-503的基因表达（表 1）。

表1 不同处理组microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相对基因表达量（n=30，±s）

表1 不同处理组microRNA-503、CDC25A和CCNE1的相对基因表达量（n=30，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.01。 下同

基因 空白对照组假手术组 模型组 西药治疗组中药治疗组m i c r o R N A-5 0 3 1.0 0±0.0 6 C D C 2 5 A 1.0 1±0.1 4 1.2 2±0.0 4 6.7 8±0.8 2*2.1 6±0.2 9△ 1.5 9±0.4 2△1.0 0±0.0 1 0.1 4±0.0 2*0.6 4±0.0 5△ 0.7 5±0.0 4△C C N E 1 1.0 1±0.2 4 1.0 4±0.1 1 0.3 1±0.0 5*0.9 9±0.0 6△ 0.9 9±0.1 2△

2.4 复元醒脑汤促进CNNE1、CDC25A蛋白水平的表达

除了从RNA水平进行相关机制的研究，我们也在蛋白表达水平上对细胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白进行了WB检测，发现中药治疗组和西药治疗组大鼠缺血脑组织中CCNE1、CDC25A的蛋白表达水平均上调。以上结果表明，复元醒脑汤和西药治疗在对疾病的治疗过程中可以通过促进细胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表达，而抑制microRNA-503的表达水平，从而影响了糖尿病脑梗死大鼠缺血脑组织中的血运重建过程（图3，表2）。

3 讨 论

复元醒脑汤治疗糖尿病脑梗死具有良好的临床效果，我们对作用机制进行了一些相关的实验研究，复元醒脑汤改善了糖尿病脑梗死患者神经功能，降低血-脑屏障的通透性，减轻了脑水肿；减轻了胰岛素抵抗；复元醒脑汤还能够提升脑组织中CXCR4、SDF-1、VEGF的蛋白的表达水平，促进神经干细胞的归巢，促进梗死区域的神经和微血管新生，缺血脑组织血供的改善，有利于神经功能的修复［20-22］。

图3 各组脑组织CCNE1和CDC25A的蛋白含量表达

表2 各组CDC25A和CCNE1蛋白的灰度扫描值（n=30，±s）

表2 各组CDC25A和CCNE1蛋白的灰度扫描值（n=30，±s）

基因 空白对照组假手术组 模型组 西药治疗组 中药治疗组C D C 2 5 A 0.3 5±0.0 3 0.4 0±0.0 4 0* 0.0 8±0.0 1△ 0.1 1±0.0 1△C C N E 1 0.6 5±0.0 7 0.5 7±0.0 6 0.2 2±0.0 2*0.7 6±0.0 8△ 0.8 8±0.0 9△

糖尿病并发脑梗死属于消渴并发“中风”，消渴以燥热为标、阴虚为本，中风主要表现为肝脏和肾脏的阴虚以及气血阻滞。糖尿病并发脑梗死的治疗应以扶持元气为本，辅以化痰祛瘀、息风泄热、醒脑开窍。自拟复元醒脑汤（治疗糖尿病脑梗死取得了良好临床疗效。方中人参大补元气为君；生天南星、石菖蒲豁痰泻浊开窍，益母草、三七、水蛭活血逐瘀；大黄泻热凉血以息风。

复元醒脑汤作为一种复方，其作用机制是多靶点的，对复元醒脑汤多种作用机制的深入研究有利于更加明确其作用机制。本研究证实，复元醒脑汤上调了细胞周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表达，降低了实验糖尿病脑梗死大鼠microRNA-503的表达。糖尿病是一种代谢性疾病，表现为胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗，同时血糖过高会造成的血管内皮细胞损伤。miRNA-503能在转录后水平调控相关靶基因蛋白质的表达的作用，参与体内葡萄糖的动态平衡的调节；miRNA-503可以调控胰岛素的分泌、胰岛的发育、胰岛β细胞的增殖与凋亡，从而调节糖类代谢。microRNA-503可以调控体内的各种血管生理功能，糖尿病脑梗死的病例状态下，microRNA-503的上调会抑制血管的新生。microRNA-503的下调不但能降低血糖，还能而改善血管内皮细胞的功能，并且能够帮助微血管网络形成，促进血管新生。二甲双胍是治疗2型糖尿病的临床常用药物，可促进脂肪组织摄取葡萄糖，使肌肉组织无氧酵解增加，增加葡萄糖的利用，减轻胰岛素抵抗，减少葡萄糖经消化道吸收。尼莫地平对脑组织受体有高度选择，容易透过血脑屏障。通过有效地阻止钙离子进入细胞内、抑制平滑肌收缩，达到解除血管痉挛之目的，从而保护了脑神经元，稳定其功能及增进脑血灌流，改善脑供血，提高对缺氧的耐受力。尼莫地平还能降低红细胞脆性及血液黏稠度，抑制血小板聚集，抗血栓形成，在适宜剂量下选择性扩张脑血管，几乎不影响外周血管。西药治疗组使用二甲双胍和尼莫地平联合用药，提高了周期蛋白CCNE1和CDC25A蛋白的表达，显著降低了microRNA-503的表达，通过微循环观察仪检测，西药治疗后脑缺血部位血管增粗，血流加快，蛋白渗漏减少。VEGF免疫荧光检测发现脑梗死大鼠梗死区域的新生血管的数量增多，血管的管径增粗。与西药治疗组相比，中药治疗组脑梗死组织的CCNE1和CDC25A蛋白表达也显著提高，microRNA-503的表达降低，同时也显著提高了梗死区域的脑部微循环，促进了梗死区域微血管的再生。这说明中药治疗组和西药治疗组都能通过CCNE1和CDC25A蛋白和micro RNA-503信号通路发挥治疗糖尿病脑梗死的作用。

脑梗死后微循环水平上的缺血，这种缺血的症状可同时启动多种损伤机制，导致缺血级联反应，最终造成神经元损伤，从而加重相应的临床症状。缺血同时还会导致血管内壁的内皮细胞的功能失调和凋亡，引起血管壁的病变。糖尿病发生后，血糖高血管新生能力下降，脑梗死后局部血氧供应降低更加显著地降低了血管新生的能力。血管新生对于脑梗死后缺血脑组织有重要的意义，新生的血管能吸收部分炎症因子和减轻脑水肿；同时还能为脑组织提供更多的营养成分，促进脑梗死组织的修复；脑梗死后充分而有效的侧支循环能够发挥很重要的作用，动脉阻塞后局部组织血液供应得到改善，也可以避免静脉阻塞后局部组织发生淤血现象。

复元醒脑汤的作为复方其作用靶点是多方面的，作用机制也是复杂的，我们从microRNA-503和CCNE1和CDC25A这条信号通路分析复元醒脑汤的作用机制，这有助于我们加深对糖尿病脑梗死病理机制的认识，同时为糖尿病脑梗死的治疗提供了新的思路。