花生鞘脂Δ8去饱和酶基因(AhSLD2)的克隆与表达分析

李昊远，郝翠翠，陈明娜，陈 娜，王 冕，潘丽娟， 王 通，禹山林，侯艳华，迟晓元*

(1. 哈尔滨工业大学(威海)海洋科学与技术学院，山东 威海 264209；2. 山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 3. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042)

农业是对环境最为依赖的脆弱产业，我国是农业大国，每年由于受干旱、低温、污染等灾害的影响，造成的损失达数十亿元。随着全球气候恶化，损失还在加剧。花生是广泛种植的油料作物，虽然花生的耐贫瘠耐干旱性较强，但花生对环境的依赖性依然较强，低温、高盐等逆境胁迫会使花生产量和品质大幅下降[1]，不仅给农民造成严重的经济损失，也给我国的食用油安全带来不良影响，因此对花生品种进行抗逆性改良具有重要意义。

鞘脂是一类脂肪酸的衍生物，由1分子鞘氨醇骨架、1分子极性基团和1分子脂肪酸长链组成[2]。鞘脂存在于所有动物、植物和真菌中，在一些原核生物和病毒中也有发现[3]。鞘脂是生物膜结构的重要组成成分[4]，占高等植物脂质的10%左右[5]，是植物细胞内膜系统的主要脂质成分，在质膜和液泡膜中含量丰富。鞘脂也是重要的调控分子，作为代谢物介导细胞程序性死亡和脱落酸依赖性信号转导的过程、植物对缺氧的响应和病原体攻击的响应等过程[6-8]。研究表明，鞘脂与植物的抗逆性相关[9]，对22个植物物种的调查研究显示，抗寒物种中的顺式t18∶1鞘脂含量明显高于其他物种。

鞘脂Δ8去饱和酶(SLD)是催化t18∶0鞘脂长链碱基(LCB)C8位去饱和生成t18∶1鞘脂的一类酶。该家族的酶结构相对保守，都含有N-末端细胞色素b5结构域和三个组氨酸保守域结构。SLD最先从向日葵中分离得到[10]，随后相继在拟南芥、烟草等植物中分离得到。拟南芥叶中85%～90%的鞘脂都含有由SLD产生的顺式或反式Δ8双键。研究还发现，不同的SLD催化产物中的顺式和反式产物的比例不同[11]。前人已从拟南芥、烟草、油菜等植物分离得到了SLD，并对其生物学功能进行了研究，但是在花生中研究较少。

本研究从花生中克隆得到了AhSLD2基因，并对基因序列信息及编码的氨基酸序列信息进行分析，利用荧光定量PCR对该基因在花生中的表达特性进行分析。研究为花生抗逆性改良提供基因资源，为阐明花生抗逆分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

花生品种为花育33号，将花生种子种于混合土中(营养土∶蛭石=2∶1)，置于光照培养箱中培养，培养周期：16 h(28℃)光照，8h(22℃)黑暗。待花生幼苗生长到三叶期时，分别采集根、茎、叶、子叶和下胚轴，在盛花期采集花。待开花下针后，分别采集其下针后10、20、30、40、50和60 d的种子。

花生生长到三叶期后分别对根和叶进行多种非生物胁迫处理。高盐处理：200 mmol/L NaCl分别对根和叶处理0、1、3、6、12、24、48、72 h；干旱处理：20% PEG6000分别对根和叶处理0、1、3、6、12、24、48、72 h；脱落酸(ABA)处理：100 μmol/L ABA分别对根和叶处理0、1、3、6、12、24、48、72 h；低温处理：4 ℃处理花生叶片0、1、3、6、12、24、48 h，花生根在低温条件下基因表达量无变化，因此本研究仅低温处理叶片。高盐、干旱处理均以清水作为对照，ABA处理以相同浓度乙醇作为对照。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成

花生总RNA的提取与cDNA的合成参照实验室之前的方法进行[12-13]。从已知的花生cDNA文库中找到了1个可能编码AhSLD2基因的全长序列，利用Primer 5软件设计基因全长引物。引物序列为SLD2-R： 5'-TAggATCCATgCAggTTgTTgAgAAg-3'，SLD2-F：5'-TTgAATTCTCAACCATgAgTgTggAA-3'。以合成的cDNA为模板进行扩增。PCR反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min，30个循环。利用琼脂糖凝胶电泳检验扩增产物并进行胶回收，将回收的产物测序。将测序得到的序列进行拼接，得到AhSLD2基因全长序列，提交到GenBank中。

1.3 序列分析

对得到的AhSLD2基因序列信息进行分析，开放阅读框利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的ORF finder工具查找；AhSLD2基因编码蛋白质的理化性质和二级结构利用在线网站ExPASy进行分析(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)；利用TMHMM工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对AhSLD2基因编码蛋白质的跨膜结构进行预测。利用Phyre2数据库预测蛋白质的三级结构，导入PyMOL软件中进行编辑(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.4 多序列比对与系统发育分析

利用NCBI数据库中Blast P工具查找与AhSLD2蛋白相似的其他植物中SLD蛋白序列，利用bioedit将挑选的蛋白序列比对分析，比较AhSLD2和其他植物中SLD蛋白的相似性和保守结构域。

对AhSLD2的进化关系进行分析，从NCBI和phytozome植物数据库中下载花生野生种(Arachisipaensi，Ai和Arachisduranensis，Ad)拟南芥(Arabidopsisthaliana，At)、大豆(Glycinemax，Gm)、蒺藜苜蓿 (Medicagotruncatula，Mt)、毛白杨(Populustomentosa，Pt)、棉花(Gossypiumraimondii，Gr)、柱花草(Stylosantheshamata，Sh)、胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea，Cs)等SLD蛋白序列，进行Clustal W比对，根据Neighbour-Joining方法构建系统发育树。

1.5 荧光定量PCR

荧光定量PCR反应条件参照陈娜等[12-13]的方法进行，每处理3次重复，内参基因为Actin11，实验数据利用2-△△Ct方法分析。荧光定量PCR引物采用Beacon Designer 7软件设计，qSLD2-F： 5' -GTTCATCGCTTATCATCCT- 3'，qSLD2-R：5' -GAGACCTCAGAGACATTG-3'。

2 结果与分析

2.1 AhSLD2基因的克隆

从花生叶片中克隆获得AhSLD2基因，其全长为1819 bp，5'非编码区为287 bp，3'非编码区为185 bp，开放阅读框(ORF)为1347 bp，编码448个氨基酸，将AhSLD2基因的序列信息提交到Gene bank中，登录号：KF358457。AhSLD2蛋白的理化性质分析结果显示，AhSLD2由448个氨基酸残基组成，理论分子量是51.9 kDa，理论等电点为8.41，带负电的氨基酸有34个(Asp + Glu)，带正电的氨基酸有38个(Arg + Lys)，在酵母和大肠杆菌中表达的半衰期分别大于20 h和10 h。不稳定系数是40.46，属于不稳定蛋白；脂肪系数为88.10。总平均疏水性为-0.013，依据氨基酸分值越高疏水性越强，分值越低亲水性越强的规律，说明该蛋白可能为亲水性蛋白。TMHMM跨膜预测结果显示AhSLD2含有3个跨膜螺旋，跨膜螺旋中的氨基酸残基数为93，存在明显的跨膜结构(图1)。图2是预测的AhSLD2蛋白的3D结构图，利用NCBI CD-search工具预测的催化位点在图中标出，分别是HIS-159/163/196/199/200/376/377和GLN-373。

图1 AhSLD2垮膜结构预测 Fig.1 Transmembrane domain prediction of AhSLD2

图2 AhSLD2三维结构图 Fig.2 The 3D structure of AhSLD2

2.2 AhSLD2蛋白序列比对分析

AhSLD2与其他植物中SLD序列比对结果显示(图3)，AhSLD2含有细胞色素b5保守结构域和三个组氨酸保守域结构。AhSLD2与蒺藜苜蓿MtSLD(AET02855)的相似性达到84%，与拟南芥中AtSLD1(NM_116023)和AtSLD2(NM_130183)的相似性分别为74%和73%，与大豆GmSLD(XP_003550268)和玉米ZmSLD(XP_020406791)的相似性分别为60%和57%，初步证明本研究从花生中分离得到的AhSLD2属于植物SLD家族。

2.3 AhSLD2蛋白系统发育分析

将花生AhSLD2蛋白与其他植物中的SLD家族蛋白进行比对，构建系统发育树(图4)，系统发育树分支根据产物鞘脂t18∶1的顺反异构体的比例分为3类(Z>E，E>Z，E)，藻类SLD催化的产物仅含有(E)t18∶1鞘脂，位于整个发育树的根部，推测其他植物SLD可能由藻类进化而来。花生AhSLD2与双子叶大豆GmSLD1/2和蒺藜苜蓿MtSLD聚在一起，与其他单子叶植物分开，从AhSLD2在系统发育树中的位置推测AhSLD2催化的产物可能主要是(E)t18∶1鞘脂。

图3 AhSLD2蛋白序列比对(b5保守结构域用下划线标出，三个组氨酸保守域结构用黑点标出) Fig.3 AhSLD2 protein sequence alignment(b5 conserved domains are underlined and three histidine box structures are marked with black dots)(Gene bank登录号AdSLD: XP_015956938, AiSLD: XP_016190948, AtSLD1: NM_116023, AtSLD2: NM_130183, GmSLD: XP_003550268, MtSLD: AET02855, ZmSLD: XP_020406791)

图4 AhSLD2蛋白系统发育树 Fig.4 Phylogenetic analysis of AhSLD2

2.4 AhSLD2基因表达特性分析

AhSLD2基因在花生不同组织和不同发育时期的表达特性如图5，AhSLD2基因在花生根、茎、叶、花和成熟种子(60 DAP)中都有表达，但在茎中的表达量显著高于其他组织。AhSLD2基因在开花下针10 d后的表达量最高，是其他时期的2倍左右。

图5 AhSLD2基因在花生不同组织和种子发育时期的表达特性 Fig.5 Expression analysis of AhSLD2 in five peanut tissues and at six stages of seed

AhSLD2基因在不同逆境处理下的表达特性如图6，在干旱处理1 h后AhSLD2在花生根中的表达量达到最大，为空白对照的21倍，随后表达量逐渐下调至初始水平，而AhSLD2在叶片中的表达量无明显变化。高盐处理下，AhSLD2基因在花生根和叶中具有相似的表达模式，都是先上调后下调，高盐处理3 h后叶中表达量达到最高，比对照上调了2.5倍，处理6 h后根中表达量达到最高，比对照上调了3.8倍。低温处理下24 h，叶片中AhSLD2基因表达量达到最高，为0 h对照的3.2倍。ABA处理1 h后，AhSLD2基因在根中显著上调，为0 h对照的14倍，处理3 h后又迅速下调至初始水平，而AhSLD2基因在叶中的表达量随ABA处理时间延长逐渐降低。

图6 AhSLD2基因在不同逆境处理下的表达特性 Fig.6 Expression analysis of AhSLD2 under adverse stress

3 结论与讨论

本研究从花生中克隆得到了AhSLD2基因，开放阅读框为1347 bp，编码448个氨基酸，属于跨膜蛋白。在前人的研究中也证实拟南芥、烟草等植物中的SLD位于内质网膜上[11]，与本文预测的结果相符。蛋白质序列比对和系统发育树结果显示，AhSLD2与蒺藜苜蓿MtSLD(AET02855)的相似性最高84%，与拟南芥AtSLD1和AtSLD2的相似性分别为74%和73%。研究人员从芜菁中分离得到了4个BrSLD基因，通过蛋白序列分析发现它们与拟南芥AtSLD的相似分别为89%、90%、86%和74%[14]，与本文得到的AhSLD2基因相比相似度更高。荧光定量结果显示，AhSLD2基因具有明显的组织特异性，在茎中的表达量最高，并且在发育初期的表达量高于其他时期。在四种逆境处理下，AhSLD2对干旱和ABA处理最敏感，且它们的表达模式相似，干旱和ABA处理1 h后AhSLD2基因在根中的表达量达到最高，分别上调21倍和14倍，随后表达量又显著下调至初始水平，结果说明AhSLD2基因可能参与花生对干旱和ABA处理下的调控作用，另外对低温和高盐胁迫也有响应，但不明显。研究人员对拟南芥中SLD的功能进行研究，发现SLD1和SLD2双突变体相比于野生型气孔直径更大，失水更快，更不耐干旱[15]。本文也证明了在花生中AhSLD2基因可能主要参与干旱胁迫下的调节。研究也表明，SLD会改变酵母菌的鞘脂成分，从而增强酵母菌的耐铝性[16]。今后，将花生AhSLD2基因转入酵母菌中，对AhSLD2蛋白的生物学功能进行更为深入的研究。