不同产地蓝莓关键品质因子分析及其抗氧化特性

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(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430000; 2.华中农业大学资源与环境学院,湖北武汉 430000)

蓝莓为杜鹃花科越桔属(Vaccinium)多年生落叶或常绿灌木,是一种营养价值很高的水果,富含糖类、维生素、蛋白质、矿质元素等。酚类物质尤其是花色苷类物质含量很高,具有广泛的生物活性、如抗炎、抗病毒、抗突变、抗癌、防止DNA 损伤、预防心血管疾病等[1]。其中很多生物活性都来源于它的抗氧化作用和对自由基的清除作用。蓝莓在世界上许多国家都有种植,我国蓝莓种植起步较晚,目前已有20年种植历史,主产区在我国东北地区,近年来在华北、江浙、辽东半岛、华南地区也有种植[2]。随着人们生活水平的提高,蓝莓果以其风味独特,营养保健功能强受到人们关注[3]。蓝莓花色苷是蓝莓中主要的关键品质因子之一,也是蓝莓中主要的抗氧化物质。有研究表明不同产地及气候条件对蓝莓花色苷的含量和抗氧化能力具有一定的影响[4]。目前,国内外有关蓝莓品质的研究多集中于不同蓝莓品种之间,而对不同产地同一品种蓝莓品质特性以及抗氧化能力差异的报道较为少见。因此,分析不同产地环境的同一品种蓝莓品质特性及其花色苷抗氧化能力,可以更加深入的了解不同产地蓝莓关键品质的差异,对蓝莓的引种及栽培生产和加工具有实际意义。有研究表明“灿烂”蓝莓品质优良,花色苷含量较高,在我国南方地区栽培广泛。

本研究拟通过对比采自南京、玉溪、贵阳、湖州四个不同地区的“灿烂”蓝莓果实为试验材料,对其内在品质,花色苷抗氧化活性进行了比较,分析了不同产地蓝莓品质指标的差异性,并对比分析了不同产地蓝莓花色苷抗氧化能力的强弱,旨在为蓝莓种植和深加工的进一步发展做出理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“灿烂”蓝莓 浙江省安吉县天子湖镇高庄村蓝莓谷、贵州省三穗县长吉乡新盘村、南京市溧水区白马石头镇、玉溪市澄江县海口镇海口村,均选择果实成熟度均匀一致,且无病、虫害的果实分别进行采收,分装在带有小孔的塑料盒(材质:高温聚酯薄膜,规格:长11 mm、宽11 mm、高4 mm、壁厚0.38 mm;厂家:义乌市尚美塑料有限公司)中,4 ℃贮藏;酚酞、邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、蒽酮、浓硫酸、硫酸铜、硼酸、亚甲基蓝、溴甲酚绿、硫酸钾、乙醇、盐酸、葡萄糖、硝酸、高氯酸、VC、乙酸钠、氯化钾、碳酸氢钠、活性炭、酒石酸氧锑钾、钼酸铵、乙酸铵、氯化钾、氯化锶、乙酸乙酯、正己烷、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸铁、过氧化氢(30%)、水杨酸、AB-8大孔树脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、甲酸、甲醇(色谱纯)等 国药集团化学试剂有限公司。

HH-2数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司;紫外-可见分光光度计 美国惠普公司;SQP电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;SHB-IIIS循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;半自动凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓理化指标分析

1.2.1.1 蓝莓总酸的测定 总酸测定按GB/T 12456-2008,采用酸碱滴定法测定。蓝莓果实用榨汁机打浆(功率:250 W、时间:2 min)后取10.00 g,转入250 mL容量瓶中,加蒸馏水至刻度、摇匀,用滤纸过滤,滤液待测。准确吸取滤液10 mL放入100 mL锥形瓶中,加入1%酚酞2～3滴,用0.01 mol/L的氢氧化钠标准溶液(以0.01 mol/L的邻苯二甲酸氢钾标定)进行滴定,计算蓝莓总酸度。

1.2.1.2 蓝莓可溶性总糖含量的测定 蒽酮比色法,取蓝莓果实用榨汁机打浆(功率250 W，时间2 min),取5 g蓝莓浆,加入20 mL蒸馏水,沸水浴30 min,冷却后4000 r/min离心15 min,重复2次,上清液过滤定容至100 mL。取1 mL稀释后的提取液与1 mL 2%蒽酮-80%硫酸(体积比1∶1)混合后,加入5 mL浓硫酸,沸水浴保温20 min,自然冷却至室温,于630 nm处测定吸光值[5]。根据上述方法测得葡萄糖标准曲线,y=0.8705x+0.0028(R2=0.9950)。

式中:N-稀释倍数,V0-测定时取样体积(mL),V1-定容总体积(mL),W-样品重量(g)。

1.2.1.3 蓝莓水分含量的测定 水分测定:参考GB 5009.3-2010,采用直接干燥法进行测定。

1.2.1.4 蓝莓蛋白质的测定 参考GB/T 5009.5-2016,采用凯氏定氮法进行测定。

1.2.1.5 蓝莓矿质元素的测定 矿物质元素测定:参考GB 5009.91-2017、GB 5009.92-2016、GB 5009.241-2017、GB 5009.90-2016与GB 5009.87-2016。

1.2.1.6 蓝莓可溶性固形物含量测定 蓝莓果实打浆(功率:250 W、时间:2 min),用手持数显糖度仪测定,直接读取得到可溶性固形物含量。

1.2.2 蓝莓花色苷提取及抗氧化能力分析

1.2.2.1 蓝莓花色苷的提取 花色苷提取方法参照陈云霞等[6]的方法,并做进一步改进。花色苷在酸性条件下比较稳定,蓝莓果实用体积浓度为60%、pH为3.0(盐酸调pH)的乙醇作为提取液,料液比1∶10 (g/mL),在40 ℃条件下提取,残渣按同样方法提取2次。滤液合并,在40 ℃条件下旋转蒸发浓缩。浓缩液存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2.2 蓝莓花色苷含量的测定 花色苷含量测定参照Lohachoompol等[7]的方法稍作修改,将1.2.2.1中得到的提取液离心抽滤,取1 mL提取液,分别用pH1.0缓冲液(1.49 g KCl用蒸馏水定容到100 mL,HCl调pH至1.0)和pH4.5缓冲液(1.64 g CH3COONa用蒸馏水定容到100 mL,用HCl调pH至4.5)定容至25 mL,分别在510、700 nm下测定吸光值,通过示差法测定。

计算公式:花色苷(mg/mL)={[(A1-A2)-(A3-A4)]×449.2×稀释倍数×1000×V}/(29600×m)

式中:A1-pH1.0稀释液在510 nm测得吸光度,A2-pH4.5稀释液在500 nm测得吸光度,A3-pH1.0稀释液在700 nm测得吸光度,A4-pH4.5稀释液在700 nm测得吸光度,V-提取液总体积(mL),m-样品质量(g)。

1.2.2.3 蓝莓花色苷分离纯化 取1.2.2.1蓝莓花色苷提取液5 mL,加入20 mL正己烷液液萃取去除脂类物质,下层萃取物继续用乙酸乙酯萃取,萃取物∶乙酸乙酯=1∶4(体积比)去除脂溶性黄酮类物质[8]。之后用AB-8大孔树脂纯化,用pH3.0(盐酸调pH)、60%乙醇洗脱,洗去糖类物质,提取液洗脱花色苷物质,悬蒸浓缩,真空冷冻干燥[9],即得蓝莓花色苷冻干粉。

1.2.2.4 蓝莓花色苷总还原能力的测定 VC浓度梯度:取VC储备液(5 mg/mL)进行梯度稀释,稀释后梯度浓度分别为:0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL。

样品的梯度稀释:取湖州、南京、玉溪、贵阳四个产地蓝莓花色苷冻干粉,用pH=3.0(盐酸调pH)的酸化水溶解,配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 mg/mL。

以铁氰化钾还原法[10]定花色苷的总还原能力,向试管中加入稀释至不同浓度的样品各2 mL,之后加入5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH=6.6)和5 mL的2%铁氰化钾溶液,随后放置在40 ℃恒温水浴锅中反应30 min,流水冷却至室温。再向其中加入5 mL 10%三氯乙酸,室温放置15 min,取5 mL的反应液,向其中加入5 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液,混合均匀,反应10 min后使用分光光度计在700 nm的波长下测定吸光度,以蒸馏水代替铁氰化钾溶液作为空白对照,以VC作为阳性对照,同样的方法测定。

1.2.2.5 蓝莓花色苷清除羟基自由基能力的测定 VC浓度梯度:取VC储备液(1 mg/mL)进行梯度稀释,稀释后梯度浓度分别为:0.01、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。

样品的梯度稀释:取湖州、南京、玉溪、贵阳四个产地蓝莓花色苷冻干粉,用pH=3.0(盐酸调pH)的酸化水溶解,配制成0.01、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。

以水杨酸法测定,向试管中加入1 mL 稀释至不同浓度的样品液,随后加入1 mL FeSO4溶液(9 mmol/L),1 mL水杨酸溶液(9 mmol/L),最后加入1 mL H2O2(2.6 mmol/L)溶液启动反应,放入35 ℃水浴保温30 min,510 nm下测定吸光值。以VC作为阳性对照,同样方法进行测定。记录吸光度值,平行测定三次,按照公式计算样品花色苷和VC的羟基自由基清除率[11]。

式中:A-反应体系中以蒸馏水代替样品测得吸光度,Ai-反应体系中样品某浓度下测得吸光度,Ai0-反应体系中以蒸馏水代替水杨酸测得吸光度

1.2.2.6 蓝莓花色苷清除DPPH自由基能力的测定 VC浓度梯度:取VC储备液(1 mg/mL,乙醇配制)进行梯度稀释,pH=3.0(盐酸调pH)的酸化稀释,稀释后梯度浓度分别为:0.025、0.05、0.075、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL。

样品的梯度稀释:取湖州、南京、玉溪、贵阳四个产地蓝莓花色苷冻干粉,用pH=3.0(盐酸调pH)的酸化水溶解,配制成0.025、0.05、0.075、0.1、0.3、0.5、0.7 mg/mL。

向10 mL离心管中加入3 mL稀释至不同浓度的样液,向其中加入3 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,乙醇配制,4 ℃冰箱避光保存),25 ℃恒温水浴锅温浴 30 min,在 517 nm波长下测定反应液吸光度,平行测定三次,以VC溶液作为阳性对照,DPPH自由基清除率的公式如下[12]。

式中:A-反应体系中以乙醇代替样品测得的吸光度,Ai-反应体系中样品某浓度下测得的吸光度,Ai0-反应体系中以乙醇代替DPPH溶液测得的吸光度。

1.3 数据处理

每个实验平行测定三次,数据处理采用SPSS 17.0(IBM公司)进行数据分析,利用Duncan新复极差法进行显著性分析,文中图采用Oringe 8.0(美国OriginLab公司)进行绘制。

2 结果与分析

2.1 蓝莓关键品质因子分析

蓝莓果实营养丰富,关键品质因子主要体现在总糖、总酸、水分、蛋白质、可溶性固形物等品质指标上[13]。由表1看出,不同产地蓝莓的总酸、总糖含量有显著差异(p<0.05);湖州产地蓝莓总酸含量最高为0.82%,贵阳产地蓝莓总酸含量最低为0.39%。总糖含量贵阳蓝莓含量最高为11.91%,湖州蓝莓含量最低为6.62%。贵阳蓝莓糖酸比最高为30.54;可溶性固形物含量为:南京>贵阳>玉溪>湖州,其中,南京蓝莓含量最高为15.03%。可溶性固形物、总酸及糖酸比无论是对鲜食还是加工果汁果酒都是重要的考量指标,鲜食蓝莓一般选用可溶性固形物含量较高,总酸含量较低,糖酸比适中的品种[14]。通过比较分析可知,贵阳产地蓝莓鲜食口感较佳。玉溪蓝莓和湖州蓝莓在水分含量和蛋白质含量方面无显著差异(p>0.05)。

表1 不同产地蓝莓理化指标(n=3)Table 1 Physical and chemical indicators of blueberries from different producing areas(n=3)

根据郑红岩[15]的研究,“灿烂”蓝莓水分含量为83.47%,蛋白质含量为545.66 mg/100 g,可溶性糖含量为3.67%,有机酸(以柠檬酸计)含量为1.75%,糖酸比为5.01。李金星等[16]报道,“灿烂”蓝莓可溶性固形物含量为12.88%,可溶性糖含量为7.04%,可滴定酸含量为0.73%。杨维[17]等发现“灿烂”蓝莓可溶性糖含量为9.58%,有机酸含量为0.52%,可溶性固形物含量为10.83%。本研究四产地“灿烂”蓝莓各关键品质因子含量与文献相比含量相当,且不同产地蓝莓关键品质因子含量均有差异。

2.2 蓝莓矿质元素分析

不同产地蓝莓果实矿质元素分析结果见表2。从表2可以看出不同产地蓝莓果实矿质元素含量不同,在所测的矿质元素中,K含量最高,含量在605.85～757.29 mg/kg。其次为Ca、P含量,Mg、Fe含量较低。K含量南京蓝莓最高,湖州蓝莓最低。Ca含量由高至低依次为贵阳蓝莓、湖州蓝莓、玉溪蓝莓、南京蓝莓。P含量四产地差异显著(p<0.05),南京蓝莓P含量最高为(86.28±1.40) mg/kg,显著高于其他三个地区,湖州和贵阳蓝莓次之,玉溪蓝莓P含量最低为(36.29±0.58) mg/kg。Fe含量南京与贵阳蓝莓无显著差异,湖州蓝莓含量最高,玉溪蓝莓含量最低仅为(2.43±0.37) mg/kg。四产地蓝莓Mg含量大小为:玉溪>贵阳>南京>湖州。姜晶[18]测得“灿烂”蓝莓K含量为830.00 mg/kg,Ca含量为92.65 mg/kg,Fe含量为60.15 mg/kg。史海芝[19]研究发现,“灿烂”蓝莓果实中K含量最高为917.00 mg/kg,P含量为98.80 mg/kg,Ca含量为77.90 mg/kg,Mg含量为51.20 mg/kg。

表2 不同产地蓝莓的矿质元素分析(mg/kg,n=3)Table 2 Mineral elements in blueberries from different producing areas(mg/kg,n=3)

通过比较分析表明,蓝莓果实的矿质元素含量差异明显。整体来看Ca、K和Mg元素含量丰富。不同品种蓝莓果实中矿质元素含量不同,不同产地同种蓝莓果实中矿质元素含量也有差异,有研究表明这是由于水果中的矿质元素含量与果树品种、土壤质地、土肥水条件和栽培管理技术等因素密切相关[20]。

2.3 蓝莓花色苷含量分析

从图1可知,四产地“灿烂”蓝莓花色苷含量存在显著差异(p<0.05)。其中,贵阳蓝莓花色苷含量最高,为(1.6418±0.0123) mg/g,南京蓝莓花色苷含量最低,为(0.8339±0.0143) mg/g。玉溪蓝莓花色苷含量为(1.1332±0.0231) mg/g,湖州蓝莓花色苷含量为(1.3430±0.0240) mg/g。四产地“灿烂”蓝莓花色苷含量在0.8339～1.6418 mg/g。吴文龙等[21]研究发现采自南京地区的“灿烂”蓝莓花色苷含量为(0.8080±0.0380) mg/g,本文测得南京地区“灿烂”蓝莓花色苷含量相与此结果一致。郑红岩等[15]测得“灿烂”花青苷含量为(1.5949±0.6750) mg/g,此结果在本实验四产地“灿烂”蓝莓花色苷含量范围内。可以看出产地不同“灿烂”蓝莓花色苷含量不同,产生这一现象的原因可能是由于产地环境因素不同。

图1 四产地蓝莓花色苷含量(mg/g)Fig.1 Anthocyanin content in blueberries from 4 different producing areas(mg/g)

2.4 蓝莓花色苷的总还原能力

一般情况下,样品的还原力与其抗氧化活性有明显相关性[22]。从图2可以看到在研究范围内(浓度0.05～1.0 mg/mL),随着VC以及蓝莓花色苷浓度的增加,吸光值逐渐增大,表明总还原能力渐增强,抗氧化活性逐渐增强,表现出良好的剂量效应关系。其总还原能力可以用半最大效应浓度EC50表示,EC50越小,表明其总还原能力越强[23]。可以看出玉溪、南京蓝莓花色苷总还原能力差异较大,贵阳、湖州蓝莓花色苷总还原能力差异较小。VC的EC50为0.067 mg/mL,四个产地花色苷的EC50分别为:贵阳0.213 mg/mL,湖州0.234 mg/mL,玉溪0.289 mg/mL,南京0.707 mg/mL。即VCEC50<贵阳花色苷EC50<湖州花色苷EC50<玉溪花色苷EC50<南京花色苷EC50。表明总还原能力VC>贵阳花色苷>湖州花色苷>玉溪花色苷>南京花色苷。李颖畅等[24]研究发现蓝莓花色苷还原能力低于同等浓度抗坏血酸还原能力,这一结果与本实验结果一致。此外李颖畅研究发现抗坏血酸还原能力约为蓝莓花色苷还原能力的2.15倍。本实验VC还原能力约为四产地蓝莓花色苷还原能力的3.18～10.55倍,这一结果与李颖畅等研究结论不一致,这可能是由于蓝莓花色苷含量及种类不同的原因。

图2 不同产地蓝莓花色苷的总还原能力的比较Fig.2 Comparison of total reducibility of blueberry anthocyanins from different producing areas

2.5 蓝莓花色苷的清除羟基自由基的能力

由图3可知,随着VC以及蓝莓花色苷浓度的增加,羟基自由基清除率也随之增加。当浓度达到0.4 mg/mL时,湖州蓝莓花色苷羟基自由基清除率为79.35%、玉溪和南京清除率相当,分别为68.65%和63.41%,贵阳蓝莓花色苷羟基自由基清除率为95.63%,此时VC的清除率已达100%。研究范围内(浓度0.05～0.5 mg/mL),阳性对照VC清除羟基自由基能力高于四产地蓝莓花色苷清除羟基自由基能力。通常用IC50值表示清除羟基自由基能力,IC50值越小,清除羟基自由基能力越强[25]。VC、湖州花色苷、贵阳花色苷、玉溪花色苷、南京花色苷IC50分别为0.1352、0.2693、0.1933、0.2918、0.3545 mg/mL。因此清除羟基自由基能力从高到低依次是VC>贵阳>湖州>玉溪>南京。

2.6 蓝莓花色苷的清除DPPH自由基能力

由图4可知,随着VC以及蓝莓花色苷浓度的增加,DPPH自由基的清除率逐渐增加。湖州、贵阳蓝莓花色苷浓度在0.025～0.1 mg/mL之间,清除率几乎呈线性增加,在此浓度范围内,VCDPPH清除率由23.8%迅速增加至66.31%,贵阳蓝莓花色苷DPPH清除率由16.32%升至43.26%。当花色苷浓度为0.7 mg/mL时,贵阳蓝莓花色苷、VCDPPH自由基清除率已达100%。四个产地花色苷的IC50分别为:贵阳0.095 mg/mL,湖州0.114 mg/mL,南京0.289 mg/mL,南京0.203 mg/mL。研究范围内(浓度0.025～0.7 mg/mL),四个产地蓝莓花色苷清除DPPH能力均小于阳性对照VC清除能力。四产地蓝莓花色苷清除DPPH能力大小为:贵阳>湖州>玉溪>南京。四个地区蓝莓花色苷清除DPPH能力有差异。这可能是由于四个地区花色苷含量及种类不同。

图4 不同产地蓝莓花色苷的清除DPPH自由基能力的比较Fig.4 Comparison of scavenging DPPH free radical ability of blueberry anthocyanins from producing areas

3 结论

本文对比了采自南京,玉溪,贵阳,湖州四个不同地区的“灿烂”蓝莓果实品质因子,比较花色苷含量及其抗氧化活性。结果表明,四地区“灿烂”蓝莓果实糖含量均较高,总酸含量在0.39%～0.82%,贵阳蓝莓含酸量最低为0.39%±0.01%。可溶性总糖含量贵阳含量最高为11.91%±0.20%,湖州含量最低为6.62%±0.04%。可溶性固形物含量贵阳蓝莓最高为12.38%,湖州蓝莓最底为11.97%。蛋白质含量由高至低依次为:玉溪蓝莓>湖州蓝莓>南京蓝莓>贵阳蓝莓;水分含量均较高,达 80.37%以上。果实中除含以上的成分外,还含有丰富的矿质营养元素,具有较高的营养保健价值,其中果实中 K、P含量最高的为南京蓝莓,Ca含量最高的为贵阳蓝莓,果实中Fe含量的最高为湖州蓝莓。其果实中的矿质元素含量综合排序为K>Ca>P>Mg>Fe均是人体不可缺少的矿物质元素。

四产地“灿烂”蓝莓花色苷含量显著差异(p<0.05),贵阳蓝莓花色苷含量最高为(1.6418±0.0123) mg/g,南京蓝莓花色苷含量最低为(0.8339±0.0143) mg/g。蓝莓花色苷总还原能力,清除DPPH自由基、羟基自由基能力,结果趋势相同,抗氧化能力强弱均为:贵阳花色苷>湖州花色苷>玉溪花色苷>南京花色苷,且均小于阳性对照VC抗氧化能力。不同产地蓝莓花色苷含量不同,抗氧化能力也有差异,总体趋势为蓝莓花色苷含量越高,抗氧化能力越强。

分析不同产地环境的同一品种蓝莓品质特性及其花色苷抗氧化能力,可以更加深入的了解不同产地蓝莓关键品质的差异,为蓝莓品种选育、种植和良种采后加工及销售提供理论参考。