小鼠肝炎病毒诊断技术的研究进展

刘森权

【摘 要】 小鼠肝炎是由小鼠肝炎病毒导致的一种传染病，小鼠肝炎病毒自然感染是经口和呼吸道途径。目前国内外的诊断技术主要有很多，例如病理学诊断、RT-PCR、IFA、MFI等。本文旨在对MHV的诊断技术做出综述，分析现有检测技术优缺点，为今后研究MHV的诊断技术提供理论依据。

【关键词】 小鼠肝炎病毒；病理学诊断；RT-PCR；免疫胶体金

MHV感染不但可以改变机体各种免疫应答参数，也可以改变其酶系统，从而影响小鼠健康，严重则影响实验结果。故MHV的早期快速检测是实验用小鼠质量检测的重要举措。本文综述了现有MHV诊断技术的研究进展。

1 病原

MHV在分类上属冠状病毒科，冠状病毒属，为单股RNA 。MHV粒子呈球形，具有多形性，直径为80～220nm，有一层脂质的囊膜。膜上结合着三种结构蛋白，分别为纤突蛋白S、膜蛋白M和小膜蛋白E[1]。现今已分离到的病毒株有MHV-1 、MHV-2 、MHV-3 、MHV-JHM、MHV-A59 、MHV -S 、MHV -Z 、MHV -U 等。其中MHV的嗜神经毒株能感染灵长类动物，引起急性的脑脊髓膜炎和脱髓鞘。MHV的自然感染途径为口及呼吸道，也可通过母婴传播。群体内的传染源是感染小鼠的粪便和垫料。不带母源抗体的乳鼠感染后发病率和死亡率较高。

2 MHV诊断技术

目前，国内外对MHV感染的诊断方法有很多，如酶联免疫吸附法、免疫荧光试验、RT-PCR等。实验室常用ELISA 、IEA等检测感染后期的特异性抗体，用病毒分离和电镜观察等来早期检测MHV感染情况 。

2.1 病理学诊断

小鼠群MHV感染时肝出现大量特征性组织损伤，而部分MHV株几乎不会引起病理学变化，所以还要通过其他方法来确诊。MHV小鼠感染任何毒株均会在肝脏上出现多个点状白色坏死灶。MHV呼吸株感染后，其肝脏血管周围淋巴细胞浸润，血管内皮细胞出现坏死，可见局灶性坏死灶，坏死灶周围肝细胞固缩。

2.2 ABC染色法

用ABC染色法可对小鼠肝炎病毒进行快速诊断，小鼠感染MHV-3后24～48h后可检测出来[1]。但ABC染色稳定性较差，必须注意亲和素与生物素酶的配比，国内也并未普及。

2.3 血清学方法

血清学方法是MHV检测技术中最常用的一种方法，可用于检测感染后期的特异性抗体。包括酶联免疫吸附法、间接免疫荧光试验、免疫酶试验、多重荧光免疫测定等。

2.3.1 酶联免疫吸附法（ELISA） ELISA检测MHV时具有高度的敏感性、易操作和耗时短等优点。但由于MHV不同毒株间抗原性存在差异，在实际检测过程中，多采用多价抗原。许宝华等[2]利用两种不同组织嗜性的小鼠肝炎病毒组合抗原包被酶标板建立间接ELISA检测MHV抗体，可检测出更多的阳性样品。但是ELISA的结果需通过肉眼观察其颜色来判定，存在一定的主观色彩。一般用于感染后期作回溯性诊断。

2.3.2 间接免疫荧光试验（IFA） IFA相对于ELISA而言特异性更高，通常作为确诊的手段。当鼠群中用ELISA检测出的阳性样本可用IFA来确诊。但是IFA的结果偏主观，不适合大量筛选的样本。

2.3.3 免疫酶试验（IEA） IEA法与ELISA法同是免疫酶技术，二者检测小鼠血清标本中MHV抗体符合率可达91. 8% 以上。既IEA法理论上也可以应用于实际。但是由于MHV 病毒不易制备IEA抗原细胞，国内未普及。

2.3.4 多重荧光免疫测定（MFI） MFI法相对于其他方法具靈敏特异性更高，可以筛选在同一个反应孔的动物血清中的多种病原体的抗体或抗原 。

2.4 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）是目前最好的确诊方法之一，其具有快速、简单和灵敏等优点。虽然目前RT-PCR的应用任然存在实验室要求高，检测时间长等局限性，但是RT-PCR具有病毒检测所需样本量少、可检测早期病毒感染的优点，也得到了研究者们的重视。

2.5 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是一种新型免疫标记技术。该技术具有很强的稳定性，操作方便快捷，且其免疫性高、特异性强。主要方法有胶体免疫层析法（GICA）和快速免疫金渗滤法（DIGFA）。GICA广泛应用于感染性疾病的调查。胡晓燕等[3]利用抗小鼠肝炎病毒多抗研制双抗体夹心法GICAs，建立了小鼠肝炎病毒快速检测方法。该方法10 min就可以检测出MHV，且重复效果良好。

2.6 逆转录环介导等温扩增检查技术（RT-LAMP）

Notomi等开发的RT-LAMP可以在等温条件下高特异性、高效率和快速的扩增DNA。不需要模板的热变性和长时间温度循环。Hanaki等发现PT-LAMP的灵敏度比PT-PCR高3.2倍，比巢式PT-PCR低31.6倍。PT-LAMP更适用于监测小鼠群中的活性MHV感染。

笔者认为，各个检测方法各有其优缺点， ELISA特异性好、重复性差敏感度低，虽然可处理大量样本但其结果偏主观，且对潜伏期感染、免疫缺陷及无血清生物者无法检测。间接ELISA有较好的特异性、重复性和敏感性，但是高低度病毒难以获得，病毒分离很复杂。IEA由于其抗原细胞难以制备，所以国内并未常使用该方法检测MHV。MFI法相对于其他方法更加灵敏特异性更高，并可以筛选在同一个反应孔的动物血清中的多种病原体的抗体或抗原。RT-PCR法有较好的特异性、重复性和敏感性，可快速简单的检测，并对潜伏期感染、免疫缺陷及无血清生物者均能检测。但RT-PCR法操作复杂，检测时间较长，对技术、设备等要求较高。逆转录环介导等温扩增检测技术有良好的特异性和敏感性，且经济高效在短时间内可完成反应，但该方法缺乏客观的标准指标。免疫胶体金技术，有很好的特异性、重复性和敏感性，且操作简单，检测更为迅速，只需要10分钟即可得到结果，但其的符合率需要进一步实验验证。

3 预防和控制

虽然MHV对环境和消毒剂的抵抗力较弱，但由于其高度传染性和变异性，使得MHV任然是实验鼠群难以消除的病毒之一[1]。预防和控制关键措施在于建立无病毒鼠群，要通过严格的检疫措施中断传播循环，从而控制该病。加强未感染鼠群的饲养管理。对引进的动物必须进行血清学等的检查。同时采用剖腹产避免MHV的垂直传播。

4 问题与展望

现如今实验动物安全性问题得到广泛重视，实验动物安全与实验人员的生命与健康及实验结果的准确性息息相关。我们应该控制MHV的感染和传播，特别是实验动物机构必须保证其售卖实验动物的质量，严格监测MHV的感染，控制MHV的传播。近年来，MHV的检测技术在不断的进步和创新，虽然进展缓慢，且各方法均存在一定的缺陷。但随着对MHV研究的不断深入，我们期望能发现更多特异性、重复性和敏感性更高的检测方法。