可降解木质纤维素的双菌共生菌丝球的制备

国巍 燕红 裴蕾

摘 要：以共固定化菌丝球的产酶能力作为指标，将木质素降解菌G13和纤维素降解菌X1012进行共固定，探讨了X1012的接入时间、接种量、pH值、摇床的转速和温度对菌丝成球和产木质纤维素酶的影响。结果表明，当G13与X1012同时接入、纤维素降解菌的接种量为20mL（100mL培养基），培养基的pH值为5、摇床转速为160r/min、温度为28℃时，锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶的酶活达到最高，分别为31.246U/L、16.048U/L、157.528U/L、197.063U/L和215.81U/L。X1012与G13在共固定过程中，具有互补的性能，在产酶的过程中发挥了协同的作用，促进了木质素降解酶的分泌。所获得的双菌共生菌丝球的球体为白色，表面光滑，大小均匀，具有一定的机械强度，能够满足实践应用的需求。

关键词：菌丝球；木质素降解菌；纤维素降解菌；木质素酶；纤维素酶

DOI：10.15938/j.jhust.2018.04.024

中图分类号： Q939.9

文献标志码： A

文章编号： 1007-2683（2018）04-0127-06

Abstract：In our research， enzyme production ability of immobilization mycelial pellet was used as an index， the immobilization mycelial pellet was immobilized with lignindegrading fungus G13 and cellulosedegrading bacteria X1012. The influence of five factors （addition time， inoculation amount of cellulosedegrading bacteria， pH， temperature and rotational speed） to Mycelium pellet， ligninase production and cellulase production were studied. The results indicated that X1012 and G13 were added simultaneously and the inoculation amount was 20%， pH was 5， culture temperature was 28℃， rotational speed was 160 r/min， the manganese（MnP）； laccase（Lac）； lignin peroxidase（Lip）； cellulose； hemicellulose were 31.246U/L；16.048U/L；157.528U/L；197.063U/L；215.81U/L， respectively. X1012 and G13 have the complementary advantage on the immobilization process， develope the synergy effects and promote the production of ligninase. The immobilization mycelial pellet was white， smooth surface， uniform size and good elasticity， which can satisfy practical needs.

Keywords：mycelia pellets；lignindegrading fungus； cellulosedegrading bacteria； ligninase； cellulase

0 引 言

制漿造纸工业每年要从植物中分离出大约14亿t纤维素[1]，同时产生含有5000万t左右木质素的污水[2，3]。木质素的结构复杂，降解困难，近年来固定化微生物技术降解木质素在制浆造纸工业废水处理上有了越来越多的应用[4-6]。固定化微生物技术具有微生物密度高，反应迅速，微生物不易流失，产物易分离等优点，是一种低耗能高效率的新技术。菌丝球是由菌丝相互缠绕而成的球体，菌丝球具有生存能力强、沉降速度快、易于固液分离、可重复利用、多孔表面积大的特点[7]。目前国内外主要着重研究单一菌株菌丝球的成球机理[8-14]，而造纸废水是一个非常复杂的混合体系，单一菌株很难达到既净化水质又降解多种废弃物的目的。本研究将能降解木质素的烟曲霉菌G13培养成菌丝球作为生物质载体，固定具有降解纤维素能力的蜡样芽孢杆菌X1012，形成兼具木质素和纤维素降解能力的复合菌菌丝球，为造纸废水处理提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

可降解木质素的烟曲霉菌G13和可降解纤维素的蜡样芽孢杆菌X1012均来自实验室前期分离筛选并保存的菌种。

1.1.2 培养基

1）PDA培养基： 去皮马铃薯200g，葡萄糖20g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4.7H2O 1.5g/L，琼脂20g/L，微量VB1，加蒸馏水配成1000mL，pH值自然，120℃灭菌20min。

2）液体培养基： NH4Cl 1g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，蔗糖10g/L，加蒸馏水配成1000mL，pH值自然，120℃灭菌20min。

3）菌丝球成球培养基：蔗糖18g/L， 酒石酸铵2.5g/L， KH2PO4 2g/L， MgSO4.7H2O 2g/L， 加蒸馏水配成1000mL，pH值自然，120℃灭菌20min。

1.1.3 实验仪器

SWCJ1FD型超净工作台（上海博迅）、HP9052MBE型恒温培养箱（上海博迅）、THZ92A型汽浴恒温振荡箱（上海博迅）、立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅）、T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用）、TGL15B型离心机（上海安亭）、S3400N型扫描电镜（日立）。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

烟曲霉菌菌悬液：将保藏于4℃的烟曲霉菌固体斜面取出，用接种环将霉菌孢子刮下，接入无菌水中，制成浓度为1×106 个/mL（血球计数法测定）的孢子悬液，4℃冰箱保存备用。

蜡样芽孢杆菌菌悬液：将保藏于4℃的蜡样芽孢杆菌固体斜面取出，用接种环刮下其斜面培养物，接入无菌水中，制成浓度为5×106个/mL（血球计数法测定）的蜡样芽孢杆菌菌悬液，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 烟曲霉菌菌丝球载体的制备

取5mL烟曲霉菌菌悬液，接入到含100mL菌丝球成球培养液的250mL锥形瓶中，于160r/min，30℃的摇床中振荡培养3d。过滤收集菌丝球，放入无菌的生理盐水中，备用。

1.2.3 各种木质素酶活力的测定

1）粗酶液的制备。

发酵液在6000r/min，4℃下离心10min，所得的上清液为粗酶液。

2）锰过氧化物酶活力测定。

向反应体系中加入3.4mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（浓度为200mmol/L、pH值为4.5），加入0.1mL 1.6mmol/L的MnSO4溶液和0.4mL的粗酶液，最后加入0.1mL 1.6mmol/L的H2O2溶液启动反应，在37℃下反应3min，测定240nm的吸光度值。一个酶活单位（U）：每分钟氧化1μmol Mn2+成为Mn3+ 的需酶量。每个样品平行操作三次，然后取平均值[15]。

3）木质素过氧化物酶活力测定。

反应液中含1mL 15mmol/L藜芦醇溶液、1.5mL酒石酸钠缓冲液（浓度为250mmol/L、pH值为3）和0.4mL粗酶液，最后加入0.1mL 20mmol/L H2O2溶液启动反应，在30℃下反应2min，测定310nm下的吸光度值。一个酶活单位（U）：每分钟氧化1μmol藜芦醇成为藜芦醛的需酶量。每个样品平行操作三次，然后取平均值[16]。

4）漆酶活力测定。

向反应体系中加入2mL乙酸-乙酸鈉缓冲溶液（浓度为200mmol/L、pH值为5）、0.5mL 0.5mmol/L的ABTS溶液和0.5mL粗酶液。在28℃条件下反应10min后，测定600nm下的吸光度值。一个酶活单位（U）：每分钟使1μmolABTS转化为ABTS自由基所需的量。每个样品平行操作三次，然后取平均值[17-18]。

5）纤维素酶活力的测定。

向反应体系中加入1mL用0.2mol/L pH4.8的醋酸缓冲液配制的0.5%的CMCNa溶液，加入1mL适当稀释的酶液，于50℃反应30min后，加入2mL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min，冷水冷却后测定530nm 的吸光度值。一个酶活单位（U）：酶活力均扣除发酵液和各种酶活测定中的底物所含的糖，以葡萄糖作标准溶液，以每分钟生成1mol葡萄糖作为一个酶活单位。每个样品平行操作3次，然后取平均值[19-20]。

6）半纤维素酶活力的测定。

向反应体系中加入1mL用0.2mol/L pH4.8的醋酸缓冲液配制的1%的木聚糖溶液，加入1mL适当稀释的酶液，于50℃反应30min后，加入2mL DNS试剂终止反应，沸水浴中煮沸5min，冷水冷却后测定530nm吸光度值。一个酶活单位（U）：酶活力的计算应扣除发酵液和底物所含的糖，以木糖作标准溶液，以每分钟生成1mol木糖作为一个酶活单位。每个样品平行操作三次，然后取平均值[21-22]。

1.2.4 菌丝球直径的测量

将20个菌丝球在平板上排成一排，用滤纸吸干表面水分，用直尺测总长再取平均值即为一个菌丝球的直径。

1.2.5 菌丝球产酶条件优化

以共固定化菌丝球的产酶能力作为指标，考察了X1012的接入时间、X1012的接种量、培养液pH值、培养温度和摇床转速五个因素，确定复合菌菌丝球的最佳成球条件。

1.2.6 菌丝球形态观察

将X1012与G13接入到100 mL（250 mL锥形瓶）成球培养基中，采用优化后的最佳培养条件培养，当形成菌丝球后，将其取出并用生理盐水冲洗，放置在培养皿中，观察其外观形态，用扫描电子显微镜（2 300倍）观察其内部形态。

2 结果与讨论

本研究将烟曲霉菌G13菌丝球作为固定化载体用于固定蜡样芽孢杆菌X1012，形成的固定化菌丝球既具有木质素降解能力，又有很强的纤维素降解活力，可应用于实际造纸废水处理。

2.1 X1012接入时间对复合菌菌丝球产酶的影响

将G13先接入到100 mL（250 mL锥形瓶）成球培养基中，接种量为5 mL，X1012以五种不同的时间接入，分别为：与G13同时接入、在G13培养的第1、2、3、4 d接入。接种量为10 mL，于160 r/min，30℃的摇床中振荡培养，每隔2 d取样测锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶，测得不同接入时间下菌丝球的五种酶活的最大值见表1。

如表1所示，X1012的接入时间不同，菌丝球的木质纤维素酶活都有着明显的差别。随着接入时间的滞后，锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶都有减小的趋势，同时接入G13和X1012，X1012会快速被不断生长的菌丝吸附并紧密缠绕，形成的菌丝球球径均一弹性好，此时的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶的酶活均为最大，分别为4.689U/L、0.273U/L、17.437U/L、80.046U/L和108.52U/L。因此烟曲霉菌和蜡样芽孢杆菌同时接入培养基中进行培养，最有利于复合菌丝球形成和产酶。

2.2 接种孢子浓度对产酶的影响

将X1012与G13同时接入到100mL（250mL锥形瓶）成球培养基中，G13的接种量为5mL，X1012的接种量分别为5、10、15、20、30mL和40mL。于160r/min，30℃的摇床中振荡培养，每隔2d取样测锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶，测得各接种孢子浓度下菌丝球的五种酶活的最大值见表2。

菌丝球直径的大小随着X1012接种量的增加而变大，当接种量超过20%时，菌丝球变的大而软，弹性非常差，不适合应用于造纸废水处理。由表2可以看出，当X1012的接种量为20%时，锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶的酶活均为最高，分别为11.242U/L、27.017U/L、115.364U/L和169.837U/L，此时菌丝球的直径约为4.15mm。因此当X1012的接种量为20%时，最有利于复合菌丝球形成和产酶。

2.3 pH值对产酶的影响

将X1012与G13同时接入到100mL（250mL锥形瓶）成球培养基中，G13的接种量为5mL，X1012的接种量为20mL。调节培养基的pH值，使其分别为2、3、4、5、6、7、8和9。于160r/min， 30℃的摇床中振荡培养，每隔2d取样测锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶，测得各pH值下五种酶活的最大值见表3。

pH值能影响微生物表面带电基团的解离，并且会影响营养物质的吸收以及代谢产物的分泌。由表3可以看出，培养液的pH值对复合菌成球的影响很大，当培养液的pH值为2、8、9时，培养基均成呈淡黄色，并且浑浊，说明过酸或过碱均不适合菌体的生长，不能成球。随着培养液pH值的增加，发酵液中的酶活也随之增加，当培养液的pH值为5时，五种酶的活性均达到最高值，分别为12.565、3.837、108.306、164.908U/L和205.801U/L。当培养液的pH值超过5时，酶活力都有所下降。因此得出结论，复合菌菌丝球适合在中性偏酸的环境下生长，当培养液的pH值为5时，最有利于复合菌菌丝球的形成和产酶。

2.4 温度对产酶的影响

将X1012与G13同时接入到100mL（250mL锥形瓶）成球培养基中，G13的接种量为5mL，X1012的接种量为20mL，培养基pH值为5。于160r/min，温度分别为24、28、30、34℃和37℃的摇床中振荡培养，每隔2d取样测锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶，测得各温度下五种酶活的最大值见表4。

表4表明，24℃时五种酶的活性最低，当温度为28℃时，锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶三种木质素降解酶的活性最高，分别为16.669U/L、4.763U/L和145.912U/L，比24℃时提高了近50%。当温度超过28℃，三种木质素降解酶活性均有下降趋势，反之纤维素酶活则明显升高，在30℃时达到最大（265.226U/L），半纤维素酶活在34℃时达到最大（235.212U/L）。据此可知，复合菌菌丝球不适宜在低温下生长，产酶活力低。综合考虑实际工程中经济能源等影响因素，选择28℃为复合菌菌丝球成球和产酶的最佳温度。

2.5 摇床转速对产酶的影响

将X1012与G13同时接入到100mL（250mL锥形瓶）成球培养基中，G13的接种量为5mL，X1012的接种量为20mL，培养基pH值为5。于转速分别为120、140、160r/min和180r/min，28℃的搖床中振荡培养，每隔2d取样测锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶，测得各转速下5种酶活的最大值见表5。

表5为摇床转速对复合菌产酶的影响。剪切力不仅能够促进介质中氧气和营养物质的传递，而且能够促进菌丝尖端的生长，缠绕成菌丝球。但是剪切力太小会影响物质在介质中的转移，菌丝得不到足够的营养，不足以支撑菌丝的生长；而剪切力太大

会增加菌丝的生长阻力和磨损阻力。随着摇床转速的增大，发酵液中酶活的值先增大后减小，转速为160r/min时形成的剪切力最有利于复合菌菌丝球的生长，此时锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶五种酶的酶活分别为17.851、4.847、149.548、157.463U/L和171.253U/L。因此，当转速为160r/min时，最有利于复合菌菌丝球的成球和产酶。

2.6 培养时间对产酶的影响

将X1012与G13同时接入到100mL（250mL锥形瓶）成球培养基中，G13的接种量为5mL，X1012的接种量为20mL，培养基pH值为5。于160r/min， 28℃的摇床中振荡培养。每隔8h取样，在600nm下测定培养液中上清液的吸光度，结果如图1所示。每d取样测量菌丝球的直径和锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶，结果如图4和图5所示。

由图1可知，菌丝球成球培养液的吸光度整体趋势是随着培养时间的延长而下降的。0-40h吸光度值下降得很缓慢，培养到16h时吸光度值突然变大，这是因为在培养初期细菌X1012大量生长繁殖，而真菌孢子形成菌丝的过程相对缓慢，X1012的生长速度大于G13形成菌丝的速度，所以吸光度变大。当培养时间为96h时，吸光度降至最低，仅为0.083，此时培养基不再浑浊，这说明G13在形成菌丝球的过程中已将X1012固定，形成混合菌丝球。由图2可以观察到所形成的复合菌丝球大小均匀，表面光滑，直径平均约为4.35mm。将混合菌丝球切开，利用扫描电镜（2300倍）观察其内部结构，在图3中可以看到菌丝球内部空间孔穴内有大量菌体，说明纤维素降解菌X1012已被很好的固定。菌丝球由菌丝体缠绕而成，内部呈现出空间网状结构，具有多孔表面积大的特点，非常适合作固定化载体。

从图4可以看出，复合菌在第2d开始成小颗粒菌丝球，随着培养时间的增长，菌丝球的直径呈增大的趋势，培养到第4d，菌丝球的直径最大，平均约为4.35mm，此后菌丝球的直径基本不变。培养至第12d，菌丝球的机械强度变差，培养基开始逐渐浑浊。第15d开始，菌丝球开始出现自溶现象。培养时间对复合菌菌丝球产酶的影响如图5所示，锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶的酶活都是先增大后减小，木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶活性分别在第4d、第6d和第7d达到最大，酶活分别为157.528U/L、31.246U/L和16.048U/L。纤维素酶和半纤维酶的酶活都是随着培养时间的增长而减小，并且均在第3d达到最大，分别为197.063U/L和215.81U/L。 在前期的工作中，将5mL烟曲霉菌菌悬液接种于100mL（250mL锥形瓶）产酶培养基中，于160r/min，28℃的摇床中振荡培养5d，取样后测得锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶的酶活分别为8.271U/L、0.95U/L和13.553U/L，明显低于复合菌菌丝球产生的三种木质素降解酶的酶活。据此可以得出结论，纤维素降解菌X1012与木质素降解菌G13具有互补的性能，在产酶的过程中发挥了协同的作用，促进了木质素降解酶的分泌。

3 结 论

1）通过考察不同因素对复合菌菌丝球产酶及成球的效果发现，复合菌菌丝球在酸性和高温的环境下仍能成球和产酶。在产酶的过程中，纤维素降解菌X1012与木质素降解菌G13发挥了协同的作用。X1012与G13同时接入、共同培养4d，复合菌的成球效果最佳。

2）菌丝球内部由大量菌丝缠绕而成，具有多孔表面积大的特点，这些特点非常符合固定化技术对载体的需求。双菌共固定化菌丝球生长稳定，产酶高效，形成的菌丝球大小均一，具有一定的机械强度，可进一步满足处理造纸废水的需要。

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（编辑：王 萍）