白菊木树皮和枝叶甲醇提取物及化学成分的体外抗炎活性研究

刘 兰， 刘燕芳， 李宝才， 张 敉

(昆明理工大学生命科学与技术学院， 云南 昆明 650500)

白菊木属(GochnatiaH. B. K.)为菊科(Compositae)中2个木本植物属之一，其中绝大部分种分布于美洲的温带和热带，仅2种分布于中国和东南亚的热带[1-4]，白菊木〔G.decora(Kurz) A. L. Cabrera〕为其一，在中国主要分布于云南南部。白菊木树皮可用于治疗肺热喘咳和枪伤刀伤[5]，但至今鲜有其化学成分和药理活性方面的研究。作者所在课题组采用多种柱色谱分离手段首次从白菊木树皮甲醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取物中分离获得30余个化合物，主要为对映-贝壳杉烷型二萜类成分，并采用脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7(以下简称RAW264.7细胞)产生一氧化氮(NO)模型对分离得到的化学成分进行活性测试，结果表明：白菊木树皮甲醇提取物及部分单体化合物的NO抑制活性良好[6-7]。在此基础上，本文研究了白菊木树皮和枝叶甲醇提取物及其中1个单体化合物15β-hydroxy-ent-16-kaur-19-oic-β-D-glucopyranosyl ester(Gd-1)对一些炎症因子的影响，以期为白菊木的后续成分研究和活性评价提实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试RAW264.7细胞购自中国科学院昆明动物研究所。供试白菊木的树皮和枝叶分别于2013年7月和2014年7月采自云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇银厂村石灰山，经中国科学院西双版纳热带植物园周仕顺助理研究员鉴定。样品自然风干。凭证标本保存于昆明理工大学生命科学与技术学院天然产物制药实验室。

分别将200 g白菊木树皮和枝叶的干样剪碎，每次用600 mL甲醇冷浸提取7 d，共3次。加压回收甲醇提取液后分别得到树皮和枝叶甲醇提取物浸膏。Gd-1的分离及鉴定参考文献[6]。树皮和枝叶甲醇提取物浸膏及Gd-1先用二甲基亚砜(DMSO)配置成一定浓度的母液，然后用DMEM高糖液体培养基稀释，备用。

主要试剂：DMEM高糖液体培养基(美国HyClone公司)；NO硝酸还原酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；胎牛血清(美国Gibco公司)；LPS、噻唑蓝(MTT)、Griess试剂盒和地塞米松(DXM)(美国Sigma公司)；TNF-α和IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(美国BD公司)；总NOS抑制剂L-NG-monomethyl arginine citrate(L-NMMA，上海碧云天生物技术有限公司)；PBS(pH 7.2至pH 7.4，上海索莱宝生物科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。

主要仪器：MK3型酶标仪(芬兰Labsystems Multiskan公司)；Thermo Forma 3111型CO2培养箱(美国Thermo公司)；BHC-1300ⅡB2型生物安全柜(苏州金净净化设备公司)；CKX1倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将RAW264.7细胞培养于含体积分数10%热灭活胎牛血清的DMEM高糖液体培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞接种于新的培养瓶继续培养，根据细胞状态以细胞悬液体积比1∶3～1∶6进行传代。

1.2.2 MTT实验 以每孔2×104个RAW264.7细胞接种于96孔板，每孔体系100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养24 h后，分别加入树皮和枝叶甲醇提取物(终质量浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及Gd-1(终浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)，以未加树皮和枝叶甲醇提取物以及Gd-1的孔为空白孔；处理24 h后，显微镜下观察细胞形态；然后每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡15 min，于波长490 nm处测定吸光度值。根据公式“细胞存活率=(检测孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%”[8]计算细胞存活率。

1.2.3 细胞内NO检测 采用Griess法[9]检测，以每孔1×105个RAW264.7细胞接种于96孔板，每孔体系100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养，设置正常对照组、模型对照组、处理(树皮或枝叶甲醇提取物+LPS)组和阳性药(L-NMMA+LPS)组，每组3个复孔；24 h后，分别加入树皮和枝叶甲醇提取物(终质量浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及L-NMMA(终浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)；孵育1 h后，各组加入LPS至终质量浓度为1 μg·mL-1，正常对照组不做任何处理；孵育24 h，收集上清液，按照Griess试剂盒说明进行检测，于波长540 nm处测定吸光度值。用标准品溶液的吸光度值和浓度绘制标准曲线，得到回归方程，计算得到各待测样品中NO的浓度。

1.2.4 RAW264.7细胞产生活性氧(ROS)检测 参考DCFH-DA荧光探针法[10]，取对数生长期的RAW264.7细胞，以每孔1×105个细胞接种于不透光的棕色96孔板，每孔体系100 μL，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养24 h后，分别加入树皮和枝叶甲醇提取物(终质量浓度0.625、2.5、10 μg·mL-1)、Gd-1(终浓度0.625、2.5、10 μmol·L-1)以及阳性药DXM(终质量浓度2.5 μmol·L-1)；孵育1 h后，各组加入LPS至终质量浓度为1 μg·mL-1，模型对照组只加入LPS至终质量浓度为1 μg·mL-1，正常对照组不做任何处理；继续培养24 h后，吸弃孔中液体，每孔加入100 μL PBS，清洗3次，每孔加入终浓度20 μmol·L-1的DCFH-DA荧光探针100 μL；继续培养30 min后，去除含有DCFH-DA荧光探针的培养基，每孔加入100 μL PBS，清洗3次，去除残留DCFH-DA荧光探针，最后每孔加入100 μL PBS；使用MK3型酶标仪(激发波长485 nm，发射波长530 nm)测定检测孔(处理组或模型对照组)和空白孔(正常对照组)吸光度值，根据公式“ROS相对含量=检测孔吸光度值/空白孔吸光度值)×100%”计算ROS相对含量。

1.2.5 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介数-6(IL-6)含量检测 参考ELISA法[11]，取对数生长期RAW264.7细胞，以每孔4×105个细胞接种于24孔板中，每孔体系1 mL，置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养24 h后，分别加入树皮和枝叶甲醇提取物(终质量浓度0.625、2.5和10 μg·mL-1)、Gd-1(终浓度0.625、2.5和10 μmol·L-1)以及阳性药DXM(终浓度2.5 μmol·L-1)；孵育1 h后，各组加入LPS至终质量浓度为1 μg·mL-1，正常对照组不做任何处理，继续孵育12 h，收集上清液，分别按TNF-α和IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒说明书进行检测。

1.3 数据处理和分析

采用SPSS 21.0统计分析软件对实验数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，应用LSD (L) test检测方差齐性，应用Tamhane’s T2 (M) test检测方差不齐性。

2 结果和分析

2.1 对RAW264.7细胞的活力及其产生NO的影响

白菊木树皮和枝叶甲醇提取物(终质量浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1)以及Gd-1(终浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μmol·L-1)与RAW264.7细胞共同孵育后细胞存活率较空白组未明显降低，且空白组和处理组的细胞形态均良好，无明显差异，未观察到白菊木树皮和枝叶甲醇提取物以及Gd-1在供试浓度下的细胞毒性。

终质量浓度0.39、1.56、6.25、25和100 μg·mL-1白菊木树皮和枝叶甲醇提取物与1 μg·mL-1LPS共培养时，对RAW264.7细胞毒性的半抑制浓度大于100 μg·mL-1，对细胞生长无明显影响，Gd-1对细胞毒性的半抑制浓度为88.346 μmol·L-1，对细胞生长的影响较弱。据此确定安全给药浓度范围分别为：白菊木树皮和枝叶甲醇提取物的质量浓度低于50 μg·mL-1，Gd-1浓度低于50 μmol·L-1。

结果显示：所有处理组均抑制NO产生，白菊木树皮和枝叶甲醇提取物抑制NO产生的半抑制浓度分别为21.11和27.15 μg·mL-1。

2.2 对RAW264.7细胞产生ROS、TNF-α和IL-6的影响

结果(表1)显示：模型对照组的ROS相对含量显著(P<0.001)升高。与模型对照组相比，各处理组的ROS相对含量均有所降低，且2.5和10 μg·mL-1白菊木树皮和枝叶甲醇提取物处理组显著(P<0.01)降低。

与正常对照组相比，模型对照组的TNF-α和IL-6含量显著(P<0.001)升高。与模型对照组相比，各处理组的TNF-α和IL-6含量均有一定程度降低，且高剂量组较显著。

处理组Treatment groupROS相对含量/%ROS relative contentTNF-α含量/(pg·mL-1)TNF-α contentIL-6含量/(pg·mL-1)IL-6 contentNCK100.00±5.41 272.86±5.10 1.32±0.65 MCK226.67±28.32 ###1 163.21±25.84 ###588.50±11.34 ###2.5 μmol·L-1 DXM68.16±4.49***797.22±26.81***184.72±7.06***0.625 μg·mL-1 SP181.16±35.741 140.43±35.38545.00±23.98*2.5 μg·mL-1 SP82.61±3.28***1 110.84±13.75530.18±4.86**10 μg·mL-1 SP70.58±12.23***925.46±14.74**412.95±10.73***0.625 μg·mL-1 ZY185.82±21.081 089.81±5.77544.84±29.862.5 μg·mL-1 ZY89.33±6.26**1 086.27±29.42454.16±4.74***10 μg·mL-1 ZY90.91±4.32**965.06±41.10**356.26±8.84***0.625 μmol·L-1 Gd-1107.25±11.86**1 140.49±88.63519.75±26.52*2.5 μmol·L-1 Gd-193.26±10.42**1 135.91±27.29520.71±18.96*10 μmol·L-1 Gd-194.55±12.16**989.75±51.91**411.89±16.38***

1)NCK： 正常对照The normal control； MCK： 模型对照The model control； DXM： 地塞米松Dexamethasone； SP： 白菊木树皮甲醇提取物Methanol extracts from barks ofGochnatiadecora(Kurz) A. L. Cabrera； ZY： 白菊木枝叶甲醇提取物Methanol extracts from branches and leaves ofG.decora. #： 与NCK组相比Compared with NCK group； *： 与MCK组相比Compared with MCK group. *** ，###：P<0.001； ** ：P<0.01； *：P<0.05.

3 讨论和结论

LPS诱导RAW264.7细胞模型广泛用于筛选潜在抗炎活性天然产物。该细胞受到LPS刺激后，能够释放ROS、TNF-α、IL-6及NO等炎症递质，从而启动抵抗炎症反应的功能[12-13]。NO是体内一种重要的生理递质和化学信使，其过量产生会引起炎症反应和机体损伤，因此，能否抑制NO产生常作为评估待测药物是否具有潜在的抗炎活性并值得进一步研究的重要指标。白菊木树皮和枝叶甲醇提取物均可一定程度上抑制NO产生，而Gd-1抑制NO产生的效果更好，其抑制NO产生的半抑制浓度为2.58 μmol·L-1[6]。而对TNF-α、IL-6及NO而言，白菊木树皮和枝叶甲醇提取物以及Gd-1的影响差异较小，且均为高剂量组效果最佳。总体上看，白菊木树皮和枝叶提取物以及Gd-1均具有潜在的抗炎活性。Gd-1为对映-贝壳杉烷型二萜类成分，该类成分可作为目标产物从白菊木树皮与枝叶中进行分离纯化及活性研究。