利用立体解剖镜和扫描电镜观察烟粉虱的形态学和发育历期

李茂业，蔡春霞，沈祥祥，张瑞平，张宗锦，刘明科，陈德鑫，闫芳芳

烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadias)，属半翅目(Hemiptera)，粉虱科(Aleyrodidae)，是经济作物(烟草、蔬菜等)上一种重要的世界性害虫[1-2]。其寄主范围广泛，为害严重，主要表现在3个方面：一是通过取食植物汁液，致使植株衰弱和生理异常[3]；二是分泌蜜露，直接污染植物或降低果实品质[4-5]；三是传播植物多种病毒[6]。2003年，Q型烟粉虱在我国云南被发现，现在已分布全国多个地区，在湖北等省份发生比例已超过B型[7-9]。近年来，对烟粉虱的研究成为热点。但烟粉虱成虫、若虫和卵个体均较小，在植物叶片上分布不具明显规律，不便于连续观测其各虫态外部形态特征和发育历期[10-11]。目前，虽有不少学者利用相关设备观察烟粉虱各虫态外部形态特征，但所获的图片不胜清晰且不系统，很难准确反映其形态特征。现代体视解剖镜和扫描电镜技术能够对材料表面微区域进行定性定量观察分析，使我们能够观察材料表面的细微形貌及内部组织特征，得到许多充满信息和色彩的清晰图像[12-13]。

本文利用NK-300体视解破镜和扫描电镜清晰记录了烟粉虱成虫、若虫和卵的外部形态特征和发育历期，并分析各发育阶段与其存活率的关系，为烟粉虱种类的准确鉴定及深入研究提供直观的技术手段。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物与昆虫：选取盆栽烟草 (NC95) 为烟粉虱供试寄主植物，将烟草播种于苗圃，幼苗生长至大约6叶期时移栽至塑料花盆内，用营养土种植，株高达到约15 cm时转移至养虫笼备用。烟粉虱虫种由青岛市中国农科院烟草研究所提供，在人工智能气候室(温度25±1℃，相对湿度60%-80%，光周期14L:10D) 用盆栽烟草 (NC95) 饲养10代以上，可获得不同虫龄烟粉虱。实验前，用吸虫器吸取烟粉虱雌虫和雄虫各10只并移入上述无虫烟苗上产卵24 h，从卵开始观察烟粉虱各虫态形态特征和发育历期及成活率。

1.2 方法

1.2.1 烟粉虱成虫、若虫和卵发育的体视解剖镜观察

将带有烟粉虱1龄若虫的烟草叶片放置在NK-300体视解剖镜(日本尼康公司)载物台上，用环形荧光光源垂直照射叶片，分叉式冷光源从左右侧面照射叶片。先应用粗调焦旋钮找到烟粉虱虫体所在位置，再用细调焦旋钮使目镜下烟粉虱虫体图像最清晰。用电脑拍照软件拍下烟粉虱不同虫态和虫龄照片并标定，跟踪观察每头烟粉虱各虫态形态和发育历期，用软件窗口测量工具栏上的测量按钮测量烟粉虱虫体的长度和宽度，记录下每个数据。将这些虫态的体长和体宽数据制作成表格并分析。每隔24小时观察测量并记录数据。如果出现有虫体连续3次的测量结果没有变化，则视作该虫体已经死亡。在以后的实验中不需要测量长度和宽度，仅作观察。

1.2.2 烟粉虱扫描电镜样品制备

用剪刀剪下带有烟粉虱卵、各龄若虫和成虫的烟草(NC95)叶片，置于-70℃超低温冰箱20 min 在冰上用导电胶将各烟粉虱虫态样品粘于扫描电镜样品台上，再置于-70℃超低温冰箱2 h，然后置于冷冻干燥机冷冻干燥24 h, 再经离子溅射法喷金, 在TM-1000 HICHMI型扫描电子显微镜下进行观测、拍照。

1.4 数据分析

对烟粉虱成虫、各龄期若虫和卵的发育时间和大小进行分析整理。首先利用DPS 7.05中ANOVA进行方差分析，然后采用Duncan’s multiple range test 法进行均数显著性比较[14]。

2 结果分析

2.1 立体解剖镜下烟粉虱成虫、各龄期若虫和卵的形态特征

烟粉虱成虫体黄色且附有蜡粉，翅白色，无斑点 (图A)。初孵若虫在叶片上无规律自由移动一段时间后就会固定下来，取食汁液。2龄若虫体较透明，腹部左右侧各出现1个黄色班点 (图D)，3龄时可见红色复眼，体周缘开始出现一些褶皱和突出(图C)，4龄时，褶皱和突出变得明显，背部棱清晰 (图B)。若虫在发育过程中体型和体色都会随着若虫的蜕皮呈周期性变化 (图B、C、D)。每一龄的若虫体色呈淡绿色至黄色，前期较浅，后期较深，体形较为扁平，但背部微隆起。卵不规则散产在叶背面，长梨形，有小柄，与叶面垂直，初产淡黄色，孵化前呈琥珀色 (图E，F)。

A: 烟粉虱成虫 Adult of Bemisia tabaci;B: 4龄若虫 4rd instar nymph;C: 3龄若虫 3rd instar nymph; D: 2龄若虫 2rd instar nymph; E: 卵块孵化Egg hatching; F: 卵块Egg masses. Ad: 成虫 Adult; Ny: 若虫 Nymph; Eg: 卵Egg; Ex: 蜕Exuviate; Sh: 壳 Shell. 比例尺Bar=100 μm.
图1 立体解剖镜下烟粉虱的形态特征

2.2 烟粉虱成虫、各阶段若虫和卵生命参数

从表1中的数据分析可以看出，烟粉虱卵、成虫和各阶段若虫的体长和体宽间存在着显著差异 (体长：F5,18=782.138，P<0.001；体宽：F5,18=439.462，P<0.001)。若虫从1龄期到4龄期，体长和体宽随龄期的增加而增大。烟粉虱卵、成虫和各阶段若虫的发育历期不同，存在显著差异(F5,18=938.583，P<0.001)。其中，成虫的寿命最长；其次为若虫，若虫中2龄期完成发育所需时间最短，4龄期所需时间最长。烟粉虱卵、成虫和若虫的发育过程中存活率存在显著差异 (表1)。

2.3 扫描电镜下烟粉虱成虫、各龄期若虫和卵的形态特征

从图2 可以清晰看到，烟粉虱成虫后足明显长于前足和中足 (图2，B，C，D，E)；若虫随虫龄的增加体长逐渐增加 (图2，B，C，D，E)、肛门发育逐渐完善 (图2，B，E，F，G)。烟粉虱若虫1龄若虫体周缘有较多分散的刚毛且长短不齐 (图3，E)；2龄体周缘刚毛退化，逐渐演变为稠密的缘齿且体表有较多分散的蜡质物(图2，D)；3龄沿体周缘均有缘齿 (图3，C)；4龄体周缘缘齿明显减少，只见于胸部边缘两侧和尾部 (图2，A，B)。这种现象表明3龄若虫缘齿最多，在取食点固定的最稳定。烟粉虱卵形如尖辣椒，表面光滑并有蜡粉附于表面，其尾部有卵柄 (图2，F)。

表1 烟粉虱卵、成虫和各龄若虫生命参数表

注：表中给出结果加减标准偏差；根据邓肯式新复极差检测法，表中相同小写字母表示0.05水平上差异不显著.

A:成虫adult B: 四龄若4 instar nymph;C: 三龄若虫3 instar nymph; D: 二龄若虫2 instar nymph; E: 一龄若虫1 instar nymph; F: 卵Egg. St: Stem 柄; Se: Setaceous 刚毛; Te: Teeth 缘齿; Wa: Wax 蜡粉; An: Anus 肛门
图2 扫描电镜下烟粉虱成虫、若虫和卵的形态特征

3 讨论

本实验利用智能立体解剖镜和扫描电镜系统地观测了烟粉虱各虫态形态特征及发育历期，本研究技术同以往的研究相比，有以下优点。首先，这种技术比较直观、连续。其次，利用连续对焦拍摄和创建对焦合成软件功能，可以得到充满信息和色彩清晰的图像。同时，利用软件测量工具对样品进行定性定量分析，可以对供试虫体长、宽、局部器官进行测量，可获得精确数据以便做进一步数学统计分析。这些技术不仅可以应用于固定昆虫的发育观察，同时也可以应用于记录昆虫等小型动物和微小型的动态行为学研究[12-13]。

烟粉虱生活史各虫态存活率顺序为成虫>若虫>卵。其中，若虫各发育阶段的存活率随若虫龄期的增加而增大。本实验中，以盆栽烟草为寄主植物，得出了和其它以辣椒、番茄等为寄主植物的试验相类似的结果[15]。在相同的环境条件下，烟粉虱在同种寄主植物上发育情况和存活率也是相对稳定[16]。

昆虫的外部形态是鉴定昆虫种类重要依据。利用昆虫外部形态鉴定昆虫种类具有的优点为昆虫外部形态直观、研究方法中间环节少、观察过程误差小和鉴定周期短[17]。本研究利用利用智能立体解剖镜和扫描电镜系统直观观察并拍照了烟粉虱各个虫态，同时，精准测量了其各个虫态的体长且鉴定周期短。

本实验烟粉虱若虫的大小和其他研究报道有所不同，可能是由于试验方法和寄主植物的不同，但可明显看出烟粉虱若虫在各龄期体长，体宽存在显著差异，这一点与其他学者研究报道的相同。若虫在整个蜕皮过程中，身体特征出现明显变化，其中包括身体厚度、红色眼点清晰度以及透明度的变化。从前一龄次蜕皮结束到下一龄蜕皮开始，身体由薄变厚，体色由透明变浑浊。根据成虫、若虫和卵体态大小和发育特点，可以准确识别烟粉虱种类、各虫态和若虫的龄期。