金霉素高产菌株选育及发酵工艺优化

解秀平

摘 要：金霉素是一种高效广谱抗生素，对多种病原菌有较强的抑制作用，适用于浅表皮肤感染。发酵效价测定：卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm 5？滋m），0.01mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇（10：3∶2），检测波长为360nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。本实验对金霉素高产菌株选育并通过不同碳源、不同蛋白胨含量等以发酵效价为指标对金霉素发酵工艺进行研究。

关键词：金霉素；工藝；研究

金霉素是一种高效广谱抗生素，对多种病原菌有较强的抑制作用，对金葡菌、化脓性链球菌、肺炎球菌及淋球菌，以及沙眼衣原体等有较好抑制作用。金霉素适用于浅表皮肤感染。

工业微生物育种是建立在遗传和变异的基础上的，没有变异，生物界将失去进化的素材；没有遗传，变异也无法积累。通过金霉素高产菌株的选育我们可以提高产品的产量和质量。本实验对金霉素高产菌株选育并通过不同碳源、不同蛋白胨含量等以发酵效价为指标对金霉素发酵工艺进行研究。

1 材料和方法

1.1 菌种

金色链霉菌（St reptomyces aureofaciens）。

1.2 材料与试剂

葡萄糖（山东西王糖业有限公司）、氯化钠（西安泰华医药科技有限公司）、硫酸铵（西安泰华医药科技有限公司）、碳酸钙（西安泰华医药科技有限公司）、磷酸氢二钾（西安泰华医药科技有限公司）、磷酸氢二铵（西安泰华医药科技有限公司）、硫酸镁（成都嘉叶生物科技有限公司）、琼脂（上海琼泽生物科技有限公司）、麸皮（河南隆霄生物科技有限公司）、蛋白胨（上海琼泽生物科技有限公司）、酵母粉（上海琼泽生物科技有限公司）、豆油（山东科兴化工有限责任公司）、玉米淀粉（苏州恒程化工科技有限公司）、小麦粉（河南隆霄生物科技有限公司）、花生粉（河南隆霄生物科技有限公司）、黄豆粉（河南隆霄生物科技有限公司）、淀粉酶（上海琼泽生物科技有限公司）、淀粉（西安智诚生物科技有限公司）、糊精（西安智诚生物科技有限公司）、蔗糖（西安智诚生物科技有限公司）。草酸（上海慈太龙实业有限公司）、乙腈（上海慈太龙实业有限公司）、甲醇（上海慈太龙实业有限公司）。

1.3 仪器

KQ-300B型10L台式超声波清器（上海楚定分析仪器有限公司）、欧洲Radwag瑞德威电子天平（深圳市怡华新电子有限公司）、LAB-UPH-10T高端型实验室超纯水机（台上式）（四川兰博环保设备有限公司）、Temp 300 双通道热电偶式温计（赛默飞世尔科技水质分析仪器）、GI-3000-12二元梯度高压液相色谱仪自动进样系统（通用（深圳）仪器有限公司）、SG-8016A数显水浴恒温振荡器（上海硕光电子科技有限公司）、PHS-3C雷磁pH计 （上海楚柏实验室设备有限公司）、SP-723上海光谱分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、HH-6030超级恒温水槽（常州万科仪器科技有限公司）、高速离心机（北京博劢行仪器有限公司）、实验室培养箱（北京博劢行仪器有限公司）、卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm5？滋m）。

1.4 培养基及培养条件

1.4.1 斜面培养基：磷酸氢二铵：硫酸镁：琼脂：麸皮：磷酸氢二钾（0.015：0.005：2.0：3.2：0.02）32摄氏度培养4天。

1.4.2 发酵培养基：氯化钠：硫酸铵：碳酸钙：蛋白胨：酵母粉：硫酸镁：豆油：玉米淀粉：花生粉：黄豆粉：淀粉酶（0.2：0.5：0.6：1.4：0.2：0.02：1.25：10：1.5：2.5：0.004），28摄氏度，转速220r/min培养7天。

1.4.3 种子培养基：酵母粉：硫酸镁：磷酸二氢钾：玉米淀粉：黄豆粉；氯化钠：硫酸铵：碳酸钙：蛋白胨（0.6：0.025：0.03：4.0：2.0：0.2：0.3：0.5：0.5），湿热灭菌二十分钟，28摄氏度，转速220r/min培养22天。

1.4.4 平板培养基

磷酸氢二铵：硫酸镁：琼脂：小麦粉：磷酸氢二钾（0.015：0.005：2.0：2.0：0.02）湿热灭菌二十分钟，32摄氏度，培养4天。

1.5 分析方法

pH测定：酸度计测定。

发酵效价测定：高效液色谱法，卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱（4.6×250mm5？滋m），0.01mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇（10：3∶2），检测波长为360nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃。

1.6 诱变处理

将金色链霉菌新鲜斜面孢子制成单孢子悬浮液，采用紫外线诱变。经紫外线诱变后的存活孢子涂于含0.9%氯化锂的平板上，培养，孢子成熟后经摇瓶发酵进行初筛和复筛。

2 结果与讨论

2.1 高产菌株选育

本实验金色链霉菌经自然分离，得金霉素，效价高达23000μg/mL。

2.2 不同碳源对GDM生物合成的影响

本实验分别采用玉米淀粉、果糖、糊精、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇等作为唯一碳源进行试验。结果表明使用玉米淀粉时效价较高。

2.3 蛋白胨单因素对生物合成的影响

本实验分别采用不同含量的蛋白胨进行试验，研究其对生物合成的影响。蛋白胨配比为0.9%时，三次实验的效价分别为22200μg/mL、22500μg/mL、21900μg/mL，平均为22200μg/mL。蛋白胨配比为1.1%时，三次实验的效价分别为23200μg/mL、23300μg/mL、22900μg/mL，平均为23133μg/mL。蛋白胨配比为1.3%时，三次实验的效价分别为21300μg/mL、21100μg/mL、21200μg/mL，平均为21200μg/mL。试验结果表明蛋白胨含量为1.1%发酵效价最高。

2.4 酵母粉单因素对生物合成的影响

本实验分别采用不同含量的酵母粉进行试验，研究其对生物合成的影响。试验结果表明酵母粉含量为0.4%发酵效价最高。

参考文献

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[2]黄俊文，冯定远，王征，谢启宇.仔猪料中金霉素与饲用酶的配伍研究[A]；中国畜牧兽医学会动物营养学分会第六届全国会员代表大会暨第八届学术研讨会论文集（上册）[C]；2000年.

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