siRNA抑制骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达及其生物学作用研究

余 天，李 娟，张伟凯，张 帆

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科，湖北 武汉 430030；

2.华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞研究与应用中心，湖北 武汉 430022；

3.华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北 武汉 430030

骨肉瘤是最常见的来源于骨的恶性肿瘤，并且常好发于儿童及青年人的干骺端。尽管新辅助化疗在骨肉瘤治疗中得到了广泛应用，但预后仍不理想，尤其是对于肿瘤转移和复发的患者。Sirtuins（SIRT1～SIRT7）蛋白家族是一类NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶和腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）-核糖基转移酶，参与机体的寿命调节、应激及炎性反应等病理生理过程。近年来研究发现，SIRT6蛋白在不同肿瘤中发挥不同作用［1-2］。Sebastián等［3］认为体内SIRT6缺乏可以促进肿瘤的生长和侵袭；Kugel等［4］认为SIRT6可以抑制胰腺癌的生长；Bhardwaj等［5］发现SIRT6可以使PKM2去乙酰化从而减少核定位信号抑制癌基因的功能。另一些研究却认为SIRT6具有促进肿瘤生成的作用，Ming等［6］发现人类鳞状细胞癌中SIRT6表达明显增高，Ran等［7］认为SIRT6可以通过染色质重排从而促进肿瘤发生。但该蛋白在骨肉瘤中的作用仍不明确。本研究运用RNA干扰（RNA interference，RNAi）的方法抑制SIRT6在人骨肉瘤细胞系U2OS中的表达，观察对骨肉瘤U2OS细胞系的生长、凋亡和侵袭性的影响，探讨SIRT6在骨肉瘤中的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和转染

人骨肉瘤U2OS细胞系由本实验室常规保存。该细胞系培养于DMEM培养基（美国Hyclone公司），并添加10%胎牛血清（美国Hyclone公司）和抗生素（美国Sigma-Aldrich公司）。置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

SIRT6 siRNA序列为：5’-CGAGGAUG UCGGUGAAUUA-3’，由广州市锐博生物科技有限公司合成，阴性对照购自广州市锐博生物科技有限公司。质粒通过LipofectamineTM2000系统（美国Invitrogen公司）转染入骨肉瘤细胞中。转染SIRT6 siRNA组为实验组，转染阴性对照siRNA为对照组。

1.2 蛋白质印迹法（Western blot）检测

分别在转染24、48和72 h后将6孔板在冰面上用预冷磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗细胞3次，加入预冷的RIPA裂解液150 μL，超声波破碎细胞，12 000 r/min离心15 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），电转移印迹到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，脱脂奶粉封闭，加入抗体温育2 h，洗涤，添加二抗（美国KPL公司）按1∶3 000稀释，并采用ECL法（美国Thermo公司）检测。结果经灰度扫描分析，以SIRT6/β-actin相对蛋白表达水平表示。

1.3 采用Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

转染48 h后收集细胞，加入80%乙醇于4 ℃用PBS漂洗3次，加入RNase溶液静置1 h，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液室温避光染色30 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡，方法按试剂盒说明书进行，采用Cellquest软件分析。以上实验重复3次。

1.4 细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测细胞增殖

收集对数生长期细胞，调整细胞密度，每孔达到1×103个，加入胎牛血清，24 h后加入细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）（上海炎彬化工科技有限公司）20 μL，培养箱温育4 h后以490 nm波长测定吸光度（D）值，以24、48和72 h为横坐标绘制生长曲线。

1.5 Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力

利用Transwell小室（美国Coring公司）检测骨肉瘤细胞侵袭和迁移能力，其中铺有基质胶的上室用于检测细胞侵袭能力，无基质胶的用于检测细胞迁移。上室加入骨肉瘤细胞及无血清DMEM溶液，下室加入600 μL含20%胎牛血清溶液诱导细胞侵袭和迁移。培养48 h后进行Giemsa染色，镜下随机选择5个200倍视野，显微镜下细胞计数，每组设3个复孔，计算其平均值。

1.6 统计学处理

数据由SPSS 13.0统计软件处理，结果以x±s表示，组间比较应用t检验和方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SIRT6-siRNA抑制骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6基因的表达

分别在转染细胞后24、48和72 h，行Western blot检测U2OS细胞系中SIRT6的表达。结果显示，24 h后实验组SIRT6蛋白的表达被显著抑制，与对照组相比下降约84%，72 h后仍较对照组减少约49%（图1）。提示SIRT6-siRNA抑制骨肉瘤细胞SIRT6蛋白的表达效果显著。

图 1 Western blot检测U2OS细胞SIRT6蛋白的相对表达Fig. 1 SIRT6 protein relative expression in U2OS cells detected by Western blot

2.2 下调SIRT6的表达对骨肉瘤U2OS细胞系增殖的影响

通过CCK-8法检测结果绘制的生长曲线显示，实验组较对照组曲线略有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

2.3 使用流式细胞仪检测细胞凋亡

转染2 4 h后使用A n n e x i n Ⅴ-F I T C双染流式细胞术行凋亡检测，实验组平均值为（1 3.8 4±1.1 8）%，较对照组［（5.6 7±0.7 2）%］凋亡增加了约3倍（图3）。说明抑制骨肉瘤U2OS细胞系SIRT6的表达后，细胞凋亡增加，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

图 2 CCK-8法检测U2OS细胞系的生长曲线Fig. 2 Growth curve of U2OS cells detected by CCK-8 method

图 3 流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡情况Fig. 3 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

2.4 Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力

用带有基质胶的Tanswell小室检测细胞的侵袭能力，转染SIRT6-siRNA 24 h后，骨肉瘤U2OS细胞穿膜细胞数为（41.67±5.02）个，与对照组［（108.84±7.21）个］比较侵袭能力明显减弱（P＜0.05），这说明抑制SIRT6可降低骨瘤U2OS细胞侵袭能力。同时利用不带基质胶的Transwell小室行细胞迁移检测，发现实验组迁移细胞个数为（57.83±4.15）个，与对照组［（140.21±5.33）个］相比显著减少（P ＜0.05，图4），提示抑制SIRT6表达可降低细胞迁移能力。

图 4 Transwell实验发现实验组细胞侵袭及迁移能力下降Fig. 4 Decreased invasion and migration abilities in the experimental group detected by Transwell assay

2.5 下调SIRT6基因表达可以增强骨肉瘤U2OS细胞化疗敏感性

通过抑制骨肉瘤SIRT6基因的表达观察在紫杉醇处理后的溶液中肿瘤细胞的生长情况，结果显示，经紫杉醇处理后，实验组和对照组72 h的D值较未处理的实验组和对照组都下降明显，分别为（0.65±0.12）和（1.12±0.18），且经紫杉醇处理的实验组下降幅度更显著（P＜0.05，图5），说明下调骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达可以增强该细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性。

图 5 应用CCK-8法检测未经及经紫杉醇处理的骨肉瘤细胞生长情况Fig. 5 CCK-8 method was used to detect the U2OS osteosarcoma cells with or without exposure to taxol

3 讨 论

SIRT6基因位于染色体19p13.3区域，其N端区域与组蛋白去乙酰化酶功能及染色质结合有关，使其具有去乙酰化酶和ADP-核糖基转移酶的活性。SIRT6在哺乳动物细胞中广泛表达，在肌肉、大脑、心脏和肿瘤细胞中的表达较丰富，SIRT6参与包括心力衰竭及心肌肥大等多种病理过程的发生、发展。

关于SIRT6在肿瘤中的作用，目前得出了许多互相矛盾的研究结论。有结论认为SIRT6是肿瘤抑制因子，Sebastián等［3］研究发现，在人类一些肿瘤中SIRT6基因缺失，从而引起糖代谢增加及肿瘤生长；SIRT6过表达后可促进乳腺癌、肝癌等肿瘤细胞发生凋亡［8］。此外，SIRT6的过表达将增加人肺癌A549细胞对放射治疗的敏感性，同时抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［9］。另一些研究也显示，SIRT6基因可能在不同的细胞中扮演不同的角色，在前列腺癌中SIRT6表达增高，下调SIRT6基因的表达可以抑制肿瘤细胞的生长，Bcl基因表达下降促进细胞凋亡，并且增加肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性［10］。同时在乳腺癌组织和人乳腺癌MCF-7细胞中SIRT6表达均升高，过表达SIRT6可使乳腺癌细胞对多柔比星和紫杉醇出现抵抗［11］。

但SIRT6在骨肉瘤中的作用还不清楚，有研究显示，骨肉瘤中SIRT6表达增加，并可促进肿瘤细胞侵袭［12］。本研究也证实，通过下调骨肉瘤U2OS细胞系中SIRT6的表达，可以显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力，并且也证实下调SIRT6表达可以促进骨肉瘤细胞在紫杉醇处理后的凋亡，从而增强骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性。McCord等［13］发现，下调SIRT6后很多细胞包括人胚肺成纤维细胞WI-38细胞对于放射引起的DNA损伤更加敏感，证实SIRT6具有稳定基因组的作用。但也有研究表明，SIRT6对不同的细胞作用不同。Wu等［14］报道，膀胱癌细胞肌肉侵犯T2期的肿瘤细胞，SIRT6表达下调并不会令肿瘤细胞对化疗药物致DNA损伤的敏感性增加。本研究证实在骨肉瘤细胞中，下调SIRT6基因的表达会增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，促进骨肉瘤U2OS细胞系的凋亡，减缓骨肉瘤细胞的侵袭能力。在将来的研究中还需要更深入地探索SIRT6对骨肉瘤生物学效应的具体分子机制，揭示该分子的确切作用。