马铃薯疮痂病菌（Streptomyces spp.）的鉴定

张建平，刘 佳，哈 斯，尹玉和，林团荣，胡 冰，张笑宇

（1.内蒙古农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.乌兰察布市农牧业科学院，内蒙古 集宁 012000；3.内蒙古农业大学农学院，内蒙古 呼和浩特 010019）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）分布在158个国家和地区，为世界上四大粮食作物之一，目前种植面积约1 920万hm2。目前，中国马铃薯种植面积约564.5万hm2，是世界第一生产大国[1]。由疮痂链霉菌（Streptomyces spp.）引致的马铃薯疮痂病为世界性病害，被视为马铃薯的第四大病害[2]。近年来，马铃薯疮痂病在中国马铃薯产区逐年加重，特别是种薯田发生更严重[3]。马铃薯疮痂病由不同的疮痂链霉菌种引致，不同种的发病条件有差异[4]，鉴定明确疮痂链霉菌种是马铃薯疮痂病防治研究的基础。

1 马铃薯疮痂病病原菌

马铃薯疮痂病病原菌为放线菌目（Actinomycetales）链霉菌科（Streptomycetaceae）链霉菌属（Streptomyces）的一些种，称马铃薯疮痂链霉菌[3]，是世界上最早描述和鉴定的一个马铃薯疮痂病病原菌种。

放线菌为形成分支丝状体的革兰氏阳性细菌，早先的分类系统将其分类为原核生物[5]。放线菌为单细胞结构，又无定形的细胞核故与细菌性状相似，但菌丝体的结构和利用分生孢子繁殖又接近于真菌。因此，将放线菌看作是细菌和真菌间的过渡类群，近代植物分类将放线菌分在植物界细菌门[6]。目前，世界上描述的放线菌目已有6个科、30多个属[3]。

链霉菌属为放线菌目中的一个属，好气腐生，包括约800个种[3]。依据形态特征和培养形态主要划分为14个类群，疮痂病链霉菌归属第七类群，即烬灰类群。由于链霉菌能产生医用抗菌素，如金霉素、氯霉素、新霉素、链霉素等，因此医学上人们给予了更多研究[3]。能引起植物病害的并不多，其中链霉菌属（Streptomyces）的一些种和近似的甘薯链霉菌（S.ipoimoea）可以引起植物病害[7]。20世纪90年代以前，国外主要报道的马铃薯疮痂链霉菌种是S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies[4]。

早期链霉菌属种的鉴定主要根据形态和培养特征上的一些微小差异来建立新种，因为没有统一的标准，容易导致混乱。1964年由国际微生物学会进行了统一链霉菌菌株和鉴定方法的工作，为此后的鉴定确定了模式菌株和统一标准[8]，也为第8版《伯杰细菌鉴定手册》提供了大量数据[9]。

20世纪80年代中期以前，链霉菌种的鉴定主要以形态、培养特征、生理生化以及对马铃薯的致病性来进行。形态特征如孢子丝的形状和排列方式、孢子表面结构、单个菌落形态，气生菌丝体、孢子堆颜色、基内菌丝体颜色和可溶性色素的有无。生理生化特性如在复杂蛋白质培养基内是否产生黑色素、对于各种碳源的利用，蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶活性和是否产生硫化氢。另外，还应说明链霉菌的生态条件、如从什么环境里分离出来，腐生还是寄生，对于湿度和酸碱度的要求。如果是抗生素筛选，还应当描述其对微生物的拮抗性[3,4]。

马铃薯疮痂病链霉菌所在的烬灰类群的主要特征是气丝灰色，基丝基本无色，孢子丝直、波曲或螺旋形，孢子圆、椭圆、柱形，孢子表面带疣、刺、毛等[3]。

20世纪80年代中期以后，链霉菌的鉴定方法除了上述特征外，也借助于现代分子生物学的方法，如16S rRNA序列测定、脂肪酸、蛋白表达特征、DNA的G+C的moL百分含量、DNA的同源性和DNA-RNA杂交等，特别是16S rRNA序列测定由于其准确性和可靠性，使分类、鉴定和亲缘关系的研究获得了很好的结果[4,10]。

2 国外马铃薯疮痂病病原菌鉴定

世界上首次报道马铃薯疮痂病菌是Thaxter[11]，1892年他在美国康涅狄格州农业试验站的报告中对马铃薯疮痂病原菌进行了描述，并将其命名为Oospora scabies。在随后的研究中Gussow[12]确定该菌不是真菌，而是一种放线细菌，并将该菌名改为Actinomyces scabies。随着1843年好气腐生菌链霉菌属的建立，疮痂病菌归属为链霉菌属，故Reynolds等[13]将其更名为Streptomyce scabies。S.scabies是最早被发现并广泛分布的一个种，其主要特征是孢子灰色、光滑，孢子链螺旋弯曲，产生黑色素，在高于pH 5.0条件下生长。中国科学院微生物所放线菌分类组在《链霉菌鉴定手册》中提到，1926年Millard和Burr从马铃薯疮痂病斑上分离和描述了肉色链霉菌S.carnosus、纤细链霉菌S.gracilis、镶边链霉菌S.fimbriatus和威德摩尔链霉菌S.wedmorensis4个种[3]。1953年在美国的缅因州首次报道了一种在pH＜4.5的土壤中引起马铃薯疮痂病的菌株，此后1968年Bonde和Mclntyre[14]、1977年Manzer等[15]以及1989年Lambert和Loria[16]的工作成功的分离到一种在pH＜4.5的土壤中引起马铃薯疮痂病的菌株并明确了其基本特征，孢子为白色或者为橙红色，孢子链呈直-柔曲状，不能产生黑色素但可以产生可溶性色素，不能利用棉子糖作为碳源等，并且产生的症状与S.scabies产生的症状不容易区分开，由此鉴定为Streptomyces acidiscabies，也称为酸性疮痂。1981年Archuleta和Easton[17]从采自美国俄勒冈州一些县的马铃薯凹陷疮痂病斑分离获得了 S.atroolivaceous，S.cinerochromogenes，S.corchorusii， S.diastatochromogenes， S.lydicus，S.malachiticus和3个未鉴定的种。1992年Christiane等[18]鉴定了以色列的菌株，结果为S.violaceus、S.gnseus、S.exfoliatus和 S.rochei 4个种。1993和1995年Faucher等[19,20]对采自加拿大魁北克省马铃薯块茎凹陷病斑的菌株鉴定为S.aureofaciens、S.albidoflavus、S.scabies和 S.acidiscubie。1995 年Lorang等[21]将来自美国明尼苏达州的菌株鉴定为S.scabies、S.albogriseolus和S.disstatochromogenes。1996年Goyer等[22]在加拿大从马铃薯凹陷疮痂病斑分离到一株致病的链霉菌株，鉴定为S.caviscabies，该菌株与S.scabies和S.acidiscabies在形态、生理上有明显不同。1998年Miyajima等[23]通过形态特征和16S rDNA序列分析鉴定了日本北海道菌株，其结果为一个新的种S.turgidiscabies，该新种明显有别于其他链霉菌的种。

上述S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies是国外20世纪90年代中期以前报道的主要种。除此之外，自20世纪90年代中期以来许多国家的学者结合形态、生理生化、分子生物学方法对马铃薯疮痂病菌种的鉴定进行了大量研究，鉴定出了许多新的种[24-49]，如美国、日本、芬兰、英国、挪威、法国、德国、韩国、瑞士、荷兰、南非、西班牙、阿根廷、埃及等鉴定出了S.europaeiscabiei， S.stelliscabiei， S.reticuliscabiei，S.luridiscabiei，S.puniciscabiei等。由于国外这方面的研究很多，这里就不一一叙述，现将20世纪90年代中期以来鉴定的马铃薯疮痂病原菌主要种归纳列入表1。随着越来越多的种的鉴定，一方面表明了马铃薯疮痂病病原菌种的多样性，同时也给种的鉴定提出了更多的挑战。

3 国内马铃薯疮痂病病原菌鉴定

中国对马铃薯疮痂病的报道最早见于1999年[50]，有关马铃薯疮痂病菌鉴定始见于2004年[51]。赵伟全等[52]对采自中国10个省（区）马铃薯疮痂病菌菌株的生物学特性和16S rDNA序列进行了鉴定，发现至少有3个种，分别为S.scabies、S.acidiscabies和一个未确定的种，结果也显示来自黑龙江和四川的菌株主要是S.scabies，来自山东的菌株主要是S.acidiscabies，来自河北、山西、内蒙古的菌株主要是一个新发现的种。2009年张萌等[53]利用16S rDNA序列对来自中国8个省（区）的34株马铃薯疮痂病菌和15株参比菌株进行系统发育研究，发现中国的马铃薯疮痂病菌有S.scabies、S.galilaeus、S.bobili、S.turgidiscabies、S.acidiscabies、S.setonii、S.diastatochromogenes、S.enissocaesilis，其 中 S.galilaeus、S.bobili、S.enissocaesilis为新种。2010年张萌等[54]基于河北、内蒙古、四川、山东、陕西、山西、黑龙江、甘肃的30株马铃薯疮痂病菌的生物学特性测试指标的聚类分析，发现病原菌主要由S.scabies、S.galilaeus、S.bobili等组成，与前期结果比较后发现，二者有一定差异，说明这些种仍然需要进一步鉴定明确。2008年杜娟等[55]对来自新疆伊犁地区具有疮痂症状的薯块进行了病原菌鉴定。经形态特征、培养特性、生理生化的测定和16S rDNA序列分析，结果为S.acidiscabies和S.scabies，其中S.acidiscabies是优势种。2013年康蓉和王生荣[56]对2011～2012年采自甘肃武威市古浪县，白银市靖远县等病害严重发生地区马铃薯疮痂病病原菌进行了分离鉴定。采用盆栽方法进行致病性测定、形态特征、生理生化特性测定和16S rDNA序列分析。结果确认引起甘肃马铃薯疮痂病的病原菌有S.scabies和S.griseus，其中S.scabies为优势种。2014年张海颖等[57]为确定河北省张北地区马铃薯疮痂病的病原，从该地区疮痂病薯病斑上分离并经温室盆栽接种，确定了6株病原菌菌株，结合菌株生物学特性和16S rDNA序列特征进行鉴定，结果表明该地区的疮痂病原菌比较复杂，但至少有S.scabies、S.europaeiscabiei和S.diastatochromogenes 3个种。2015年王丹等[58]为明确山西晋城马铃薯疮痂病原菌种类，对其菌株进行了致病性、形态学、生理生化特性和16S rDNA序列测定，结果鉴定为S.scabies。2016年邢莹莹等[59]对2012～2013年从黑龙江省克山县、绥化市、哈尔滨市、杜尔伯特蒙古族自治县采集具有疮痂病斑的马铃薯块茎分离纯化病原菌，对其进行16S rRNA和致病性鉴定，共分离出74株菌株，鉴定出致病性菌株26株，其中S.scabies或S.europaeiscabiei 21株，S.turgidiscabies3株和S.acidiscabies2株。2016年杜魏甫[60]对云南昆明、曲靖、楚雄、普洱、临沧、红河等地多点采集具有典型疮痂病病斑的马铃薯，分离得到链霉菌143株，结合形态学和16S rDNA分子方法鉴定出7种链霉菌，分别是S.anulatus、S.scabies、S.acidiscabies、 S.griseus、 S.europaeiscabiei、S.caviscabies和 S.enissocaesilis。其中，S.anulatus、S.caviscabis首次在国内发现。通过致病性鉴定发现，该7种病原菌均能引起不同程度的疮痂病症状。2017年杨梦平等[61]通过形态、生理生化、致病性和16S rDNA序列分析，将从云南省13个马铃薯主产区采集分离到的67株致病菌鉴定为S.caviscabies，S.anulatus，S.scabies，S.turgidiscabies，S.acidiscabies， S.europaeiscabiei， S.luridiscabiei，S.enissocaesilis，S.griseus和 S.aureofaciens。其中S.enissocaesilis和S.anulatus为优势种群，S.caviscabies，S.anulatus和S.luridiscabiei为国内首次报道。2017年王甄[62]通过对病原菌的纯化分离和分子鉴定发现恩施地区马铃薯疮痂病菌的致病种类主要是S.scabies，S.acidiscabies，S.turgidiscabies 3个种，其中危害面积比较广的是S.scabies。为简明清晰将上述结果归纳于表2。

表1 国外已报道的马铃薯疮痂病菌种类Table 1 Reported species of Streptomyces causing potato scab from abroad

表2 国内已报道的马铃薯疮痂病菌种类Table 2 Reported species of Streptomyces causing potato scab in China

上述国内马铃薯疮痂病原菌种的鉴定研究基本明确了所采集样本地区的疮痂病原菌种类，同时也表明不同省份的疮痂病原菌种类有所不同，说明其遗传存在着明显多样性，也证实了马铃薯疮痂病原菌分布的地域性差异。因此，需要明确当地马铃薯疮痂病病原菌的种类、分布和优势种，才能有针对性地进行防治研究。还应该注意的是，样本采集应覆盖所有马铃薯种植区域，以便获得所研究区域所有马铃薯疮痂病的病原菌种类。