苯甲酸钠对斑马鱼胚胎发育的影响

罗燕燕　程定一　谭恋琴　利芳云　蒋星雨　杨玉舒　肖福英

【摘 要】【目的】通过不同浓度苯甲酸钠对斑马鱼胚胎发育的影响，初步探讨苯甲酸钠的毒理性质及对生物产生的影响。【方法】采用不同浓度的苯甲酸钠培养液，用于斑马鱼胚胎的发育影响，观察，统计孵化率、孵出仔鱼畸形率、死亡率等生理指标。【结果】斑马鱼直接暴露在苯甲酸钠溶液中，8h后高浓度组（10000mg·L-1）会造成外包层变薄，16h后实验组卵黄形状不规则，24h后实验组已出现黑色素的沉积，浓度大于1000mg·L-1的实验组存在尾部发育不全、脊柱弯曲的个体，随苯甲酸钠的浓度升高马鱼胚胎死亡率上升，3天后死亡率，高浓度组达30.5%，畸形率9%。与对照组有显著性差异（P<0.05）。【结论】低浓度的苯甲酸钠对斑马鱼胚胎发育无显著影响，但高浓度（浓度大于1000mg·L-1时）会导致胚胎发生黑色素沉积、个体发育不全等畸变。

【关键词】苯甲酸钠；斑马鱼；胚胎；畸变

中图分类号： TS207.3 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）17-0077-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.17.038

【Abstract】Objective： to preliminary discuss and explore the toxicological properties of Sodium benzoate and its effects on biological production by studying the effects of different concentrations of Sodium benzoateon zebrafish embryo development. Method： differentconcentrationsofsodium benzoate culture medium were used for the development of zebrafish embryos， and the physiological indexes such as hatching rate， hatching larval rate and mortality were observed and recorded. Result：The zebrafish was exposed directly to sodium benzoate solution. After 8h， the outer layer became thinner at high concentration（10000mg·L-1）.After 16h， the shape of yolk in experimental group was irregular. After 24h， the deposition of melanin in experimental group was more than In the 1000 mg·L-1 experimental group， there was tail hypoplasia and spinal curvature. The embryo mortality of the fish increased with the concentration of sodium benzoate. After 3 days， the mortality rate was 30.5% in the high concentration group and the rateof deformity was 9%. There was significant difference with the control group（P<0.05）.Conclusion： Sodium benzoate at low concentration has little effect on zebrafish embryos，but high concentrations（at concentrations above 1000mg·L-1）lead to embryonic aberrations.

【Key words】Sodium；Benzoate；Zebrafish；Embryo；Aberration

0 引言（Introduction）

斑馬鱼（Danio rerio）作为一种新型脊椎动物模式生物，除了具有脊椎动物的基本特点，其与人类基因具有87%的同源性、器官发育与人类非常相似、胚胎透明、发育速度快，受到模式动物研究者的高度青睐[1-2]。自1981年Streisinger等首次提出在斑马鱼上进行发育和遗传学的研究以来，发表了一系列利用斑马鱼进行大规模突变体筛选的论文，成为这种新型脊椎模式动物步入发育、遗传和疾病研究的里程碑[3-9]。近些年，在以斑马鱼为模型进行药物筛选方面，也取得了一系列重要进展[10-11]。苯甲酸钠作为常用添加剂，广泛用于食品、药品、颜料、生物标本等，在世界各地均被广泛使用[12-15]。然而对其毒性的的影响在有些国家已经停止生产，并对它的使用作出限制]。目前在我国仍被作为防腐剂广泛用于食品和药品中，通过饮食等途径被人体摄入，积少成多可能对人体造成一定的危害[16-20]。本文通过对斑马鱼胚胎进行不同浓度苯甲酸钠的培养液进行染毒饲养，检测孵化率、孵出仔鱼畸形率及死亡率等几项生理指标，客观评价苯甲酸钠对生物的影响。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 实验材料

野生型斑马鱼（AB品系），来源于上海佳誉水族馆。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼胚胎的准备

挑选发育正常的野生型斑马鱼成鱼雌雄交配（雌：雄=1：2），收集受精卵置于胚胎培养箱中恒温孵育。胚胎发育至1h后挑选发育期同步的胚胎继续培养。发育至3h时，将同步发育的胚胎分选到6孔板内，每孔20粒[13-15]。

1.2.2 药物处理

苯甲酸钠购置胚胎发育至3h时进行药物处理。小心吸出6孔板中的培养液，沿小室壁缓慢轻柔的加入含有待测药物的胚胎培养液。轻轻分散胚胎，避免聚集。置于胚胎培养箱中孵育至5h发育期时换液一次，继续培养至7h发育期。6组浓度分别为0mg·L-1、10mg·L-1、100mg·L-1、1000mg·L-1、10000mg·L-1的苯甲酸钠，每次实验设置一个对照组，重复实验10次。

1.2.3 结果观察与数据处理

胚胎发育过程中，定时将斑马鱼胚胎于显微镜下观察胚胎生长状况计数并拍照记录器生长状态。

2 实验结果（Results）

2.1 胚胎发育形态学观察

斑马鱼受精卵呈半透明状，通过普通光学显微镜可以很清楚地观察到斑马鱼胚胎各时期的发育。本实验共观察了对照组斑马鱼胚胎发育的五个时段，各时段形态学特征见表一。对照组（A）以及各剂量组（B～E）斑马鱼不同发育时期的形态学变化见图1 。

从图1 观察到受精后4小时，对照组及苯甲酸钠实验组囊胚发育正常，发育8h，对照组出现外包活动，原肠胚开始出现，但E组（浓度10000mg·L-1）胚胎的外包层较薄，厚度约为对照组的一半见图1-j。16h，对照组出现眼泡和肌节，苯甲酸钠实验组卵黄形状普遍为不规则形。24h后差异更加明显，对照组尾部开始延伸并脱离卵黄，实验组已出现黑色素的沉积，同时其中浓度大于1000mg·L-1的实验组存在尾部发育不全、弯曲的突变个体（见图1-t）。48h时，对照组斑马鱼的黑色素开始沉积。实验组黑色素沉积相对较多，其中还存在脊柱弯曲的畸变现象见图1-x。

2.2 胚胎死亡率及畸变率观察

10次实验，每组共获得200粒受精卵，发育3天后的死亡率及畸变率见表二，不同浓度苯甲酸钠对斑马鱼胚胎死亡率（图2）及畸变率的影响见图3。

3 统计学分析（Analysis）

根据卡方检测可得，当苯甲酸钠浓度为10 mg·L-1时，死亡率9.5%，P<0.05；实验组与对照组有显著的差异，当浓度大于100 mg·L-1时，死亡率从11.5%-30.%，P<0.01；实验组与对照组有极显著的差异。

4 讨论（Discussion）

生物在胚胎发育早期极易受外界环境的影响，会造成死胎、畸形等，本研究低浓度苯甲酸钠对斑马鱼胚胎畸变率的影响不是很明显，当浓度升高到1000mg·L-1时，斑马鱼胚胎开始出现畸变，畸变率为3.5%，当苯甲酸钠浓度上升到10000mg·L-1时，斑马鱼畸变率升高至9%，所以，高浓度苯甲酸钠（浓度大于1000mg·L-1）会提高斑马鱼胚胎的畸变率。

10mg·L-1以及100mg·L-1浓度的苯甲酸钠对斑马鱼胚胎的死亡率无明显影响。1000mg·L-1浓度下，斑马鱼的死亡率明显升高。死亡率由5.5%升高到23.5%。尽管在24h时和48h时，胚胎具有各方面的形态，但其黑色素沉积增多。 10000mg·L-1濃度下斑马鱼胚胎的死亡率可达30.5%，出现了个别个体的畸变现象。实验结果中死亡率与文献[21]报道一致，但该文献中并没有对畸变率进行数据分析。

当浓度大于1000mg·L-1时，胚胎的黑色素沉积明显增多。黑色素的合成过程中，络氨酸酶是关键酶，其催化黑色素合成途径中的两个初始步骤，即络氨酸羟基化成3，4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）和DOPA氧化成多巴醌。然后多巴醌可由两条独立的途径生成黑色素。整个合成过程涉及了眼皮肤白化病二型（OCA2）、络氨酸酶（TYR）、多巴色素互变酶（DCT）、络氨酸酶相关蛋白等多个基因，可推测黑色素沉积可能是苯甲酸钠浓度上升使黑色素合成机制代谢旺盛，比如导致络氨酸酶的分泌增加，或是导致胚胎的相关基因发生突变，使得这些基因表达，这一结果可对人类皮肤黑色素疾病方面的研究有一定的提示。

5 结论（Conclusions）

本研究可得出如下结论：一定浓度的苯甲酸钠能够影响斑马鱼的胚胎发育，造成胚胎发育迟缓，黑色素沉积和畸变率上升。其中死亡率与苯甲酸钠浓度呈正相关，所得死亡率的P值均小于0.05，认为实得资料与理论比例间有显著差异。苯甲酸钠在低浓度情况下并未造成胚胎发育的异常，可适量添加于药品及食品中充当防腐剂，但浓度大于1000mg·L-1时，可对生物体造成伤害。

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