蒸发光散射检测器－高效液相色谱法测定小儿化毒胶囊中胆酸和猪去氧胆酸含量

吴 芳 ，罗定强 ，李 青 ，赵珊珊 ，刘海静 ，

（1.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710061； 2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

小儿化毒胶囊有清热解毒、活血消肿功效，用于小儿疹后余毒未尽、烦躁、口渴、口疮、便秘等症。现行质量标准收载于《国家药品标准·新药转正标准（第50册）》，原处方规定使用牛黄投料，后根据国家食品药品监督管理局相关文件，经批准将处方中的牛黄修改为人工牛黄进行投料，现行标准中含量测定项为使用薄层色谱法测定人工牛黄中胆酸的含量，方法的专属性和重复性均欠佳。该品种的系列制剂小儿化毒散现收载于2015年版《中国药典（一部）》，标准中亦缺少对人工牛黄的定量控制方法[1]。小儿化毒胶囊为儿科用药，质量标准应予以更合理和严格的控制。本研究中采用蒸发光散射检测器－高效液相色谱（ELSD－HPLC）法同时测定方中胆酸和猪去氧胆酸的含量，方法科学、简便，可有效控制小儿化毒胶囊中人工牛黄的质量，并可为同系列制剂提供方法依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters1525／2487型高效液相色谱仪，Empower色谱工作站（美国 Waters公司）；BS224S型，BS223S型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ－500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Alltech ELSD3300ES蒸发光散射检测器（美国奥泰科技＜中国＞有限公司）。

1.2 试药

胆酸对照品（批号为 100078－201415，含量为98.9%），猪去氧胆酸对照品（批号为100087－200610，含量为97.3%），均由中国食品药品检定研究院提供。小儿化毒胶囊样品共9批（批号分别为20091，10021，60161，10011，10061，10031，10051，60171，20081），阴性样品及人工牛黄药材均由西安碑林药业股份有限公司提供，且由罗定强副主任药师鉴定，符合药典相关规定。乙腈为色谱纯（Avantor Performance Materials Sda Bhd），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[2－5]

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 －0.1% 冰醋酸溶液（40 ∶60）；ELSD 漂移管温度：98℃；空气流速：3.0 mL／min；流速：1.0 mL ／min；柱温：35 ℃。

2.2 溶液制备

对照品溶液：称取胆酸对照品和猪去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL中各含0.2 mg的溶液，摇匀，即得。

供试品溶液与阴性对照品溶液：分别取小儿化毒胶囊内容物、阴性样品适量，研细，取约3 g；人工牛黄研细，取约 45 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，水浴加热回流30 min，放冷，滤过，用适量甲醇洗涤容器和滤纸，合并滤液，蒸至近干，加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，摇匀，滤过，即得。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取胆酸对照品10.80 mg（含量为98.9%），猪去氧胆酸对照品11.52 mg（含量为97.3%），精密称定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，折纯度后质量浓度分别为1.068 g／L和1.121 g／L；分别吸取 1，2，3，5，8，10 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进行测定，以对照品进样量的对数值（X，μg）为横坐标、峰面积积分值的对数值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：胆酸 Y＝1.46X＋5.83（r＝0.999），猪去氧胆酸 Y＝1.46 X＋5.68（r＝0.999），胆酸进样量线性范围为1.068～10.680 μg，猪去氧胆酸进样量线性范围为 1.121 ～ 11.210 μg。

专属性试验：取阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样。结果未出现与对照品溶液色谱中胆酸与猪去氧胆酸对照品保留时间相同的色谱峰，阴性对照无干扰，详见图1。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液10 μL，按拟订色谱条件操作，重复进样6次。结果胆酸和猪去氧胆酸峰面积积分值的 RSD分别为2.90%和2.28%（n＝6），表明仪器精密度良好。

图1 高效液相色谱图

稳定性试验：精密称取同一供试品（批号为20081），依法制备供试品溶液，分别于配制后每隔4 h测定。结果胆酸和猪去氧胆酸峰面积积分值的 RSD分别为3.0%和2.1%（n＝6），表明供试品溶液在20 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20081）样品6份，依法制备供试品溶液,测定。结果胆酸的平均含量为0.774 mg／g，RSD 为 2.23% （n＝6）；猪去氧胆酸的平均含量为 1.050 mg／g，RSD 为 2.71% （n＝6）。平均装量为0.312 2 g，每粒含有胆酸和猪去氧胆酸的总量为0.570 mg。

加样回收试验：取胆酸对照品14.54 mg，猪去氧胆酸对照品14.60 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取6份溶液各1 mL，置锥形瓶中，再精密称取6份样品（批号为20081）各1 g，分别依次置上述锥形瓶中，按2.2项下方法制备供试品溶液并测定。结果见表1。

2.4 胆酸和猪去氧胆酸转移率

取人工牛黄药材适量，制备供试品溶液，测得人工牛黄中胆酸的含量为5.05%，猪去氧胆酸的含量为7.23%。按其含量及处方进行计算，样品中胆酸的转移率为96.5%，猪去氧胆酸的转移率为91.5%。

2.5 样品含量与限度测定

依法测定8批样品含量，结果为每粒0.570～0.659 mg。按此结果，考虑批间差异、药材差异等的影响，含量限度暂定为：本品每粒含人工牛黄以胆酸（C24H40O5）和猪去氧胆酸（C20H27O11）的总量计，不得少于0.40 mg。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

3 讨论

人工牛黄中的胆酸为胆甾酸类成分，分子结构中无共轭双键，在紫外－可见光区吸收不明显。《中国药典（一部）》人工牛黄项下收载的含量测定方法及方法后附的原料含量测定方法均为采用糠醛溶液显色后进行紫外测定。另有采用薄层色谱法[6]或高效液相色谱－紫外检测（HPLC－UV）法测定胆酸和猪去氧胆酸的含量[7－8]。但经试验，两者色谱峰在紫外检测器下响应值很低，且受其他成分干扰，色谱峰几乎难以辨认。在蒸发光散射检测器下信号较强，色谱峰响应值较大，与周围色谱峰分离良好。故蒸发光散射检测器用来测定胆酸类物质较为理想[9]。

考察超声提取30 min、回流提取30 min、回流提取40 min 3种提取方式，结果回流提取30 min制备的供试品溶液中胆酸和猪去氧胆酸的含量最高。根据测定结果，选定回流提取30 min为溶液的提取方式。

人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成[1]，胆酸和猪去氧胆酸为其中含量最高的2种化学成分，质量控制方法研究较成熟[10－12]。人工牛黄为天然牛黄的代用品，部分含有天然牛黄的制剂品种使用人工牛黄进行替代，但标准项下并未进行相应的检验检测项目的完善和提高，建议应及时进行标准提高工作，完善人工牛黄的质量控制方法。