乙肝灵胶囊质量标准改进研究

黄 艳 ，罗定强 ，李 青 ，袁芬越

（1.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710061； 2.陕西东泰制药有限公司，陕西 咸阳 712000）

乙肝灵胶囊是由大黄、白芍、茵陈、柴胡、贯众、甘草、人参、黄芪8味中药材组方的中药复方制剂，有清热解毒、疏肝健脾的功效，适用于肝气郁滞、湿邪困脾及乙型病毒性肝炎。方中大黄、白芍为君药。大黄苦、寒，泻热通便，利胆逐瘀；白芍苦酸，微寒，养阴和血，柔肝止痛。两者配伍，清利疏养并举。该药品现行质量标准为国家食品药品监督管理局药品标准YBZA17522005－2009Z，其存在部分薄层色谱重现性差、斑点不清晰，且对大黄未进行含量控制的问题。陈光芝等[1]采用高效液相色谱（HPLC）法测定了乙肝灵胶囊中芍药苷含量，而其他药味未见文献报道。为有效控制乙肝灵胶囊的质量，本研究中在对原有鉴别项进行方法学验证的基础上，对大黄、人参的薄层色谱（TLC）法进行了修订，增加甘草的TLC鉴别和大黄中土大黄苷的薄层色谱检查，用HPLC法测定大黄中大黄素和大黄酚的总量，以实现对乙肝灵胶囊质量的有效控制。现报道如下。

1 仪器与试药

1.2 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪，2489紫外检测器，Empower工作站（美国 Waters公司）；AE204型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药

大黄对照药材（批号为 121676－201201），大黄酸对照品（批号为110757－200206），大黄酚对照品（批号为 110796－201520，含量为 99.2%），人参皂苷 Rb1对照品（批号为 110704－201424），人参皂苷 Re对照品（批号为 110754－201324），甘草对照药材（批号为120904－201318），土大黄苷对照品（批号为 110794－201306），大黄素对照品（批号为 110796－200110），均购自中国食品药品检定研究院；乙肝灵胶囊（陕西省东泰制药有限公司，批号分别为 6B01，6B02，6B03）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；甲醇为色谱纯（美国Honeywell公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

大黄[2]23，495：取含量测定项下的供试品溶液作为供试品溶液。另取50 mg大黄对照药材，置具塞锥形瓶中，加甲醇10 mL，45 min水浴回流提取，滤过，蒸干滤液，残渣加入8%盐酸溶液10 mL，于沸水浴中加热1 h，冷却至室温，转移溶液置分液漏斗中，用30 mL乙酸乙酯分3次提取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇1 mL溶解，作为对照药材溶液。再取大黄酸对照品、大黄酚对照品，分别加甲醇制成质量浓度为1 g／L的溶液，作为对照品溶液。按处方比例、工艺制备取不含大黄药材的阴性样品0.8 g，按2.3.2项下供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照TLC法（2015年版《中国药典（四部》通则0502）试验，吸取供试品溶液和阴性对照品溶液各6 μL，对照药材溶液和对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与大黄对照药材溶液色谱和大黄酸、大黄酚对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1。

图1 大黄的薄层色谱图

人参[2]468,[3－4]：取本品内容物 6 g，置索氏提取器中，加适量乙醚，加热回流至提取液无色，弃去乙醚液，挥干药渣，再加入100 mL甲醇，加热回流至提取液无色，放冷至室温，提取液蒸干，用30 mL水分次溶解残渣，转移至分液漏斗中，用90 mL水饱和的正丁醇分3次振摇提取，正丁醇提取液合并，用90 mL氨试液分2次洗涤，正丁醇液蒸干，用10 mL水溶解残渣，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），按50 mL水、40 mL 40%乙醇和60 mL 70%乙醇的顺序洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇1 mL溶解残渣，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品，分别用甲醇制成质量浓度为1 g／L溶液，作为对照品溶液。按处方比例、工艺制备取不含人参药材的阴性样品6 g，同供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照TLC法（2015年版《中国药典（四部）》通则0502）试验，上述3种溶液各吸取5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与人参皂苷Rb1、人参皂苷Re对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点及荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图2。

图2 人参的薄层色谱图

甘草[2]86，[5－7]：取本品内容物 1.5 g，置具塞锥形瓶中，量入30 mL甲醇，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，用10 mL水溶解残渣，调节pH至9～10，用60 mL水饱和的正丁醇液分3次提取，弃去正丁醇提取液，水液调节pH至2～3，用60 mL水饱和的正丁醇液分3次提取，提取液合并，用60 mL正丁醇饱和的水分次洗涤2次，蒸干提取液，用甲醇5 mL溶解残渣，作为供试品溶液。另取甘草对照药材0.5 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。再取按处方比例、工艺制备不含甘草药材的阴性样品1.5 g，同法制成阴性对照品溶液。照TLC法（2015年版《中国药典（四部）》通则 0502）试验，取上述3种溶液各2～5 μL，分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，展开剂为乙酸乙酯 －甲酸 －冰醋酸 －水（15∶1∶1∶2），展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与甘草对照药材溶液色谱相应位置上显相同的黄绿色荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图3。

2.2 土大黄苷检查[2]23，[8－11]

取本品内容物1 g，置具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇，超声处理 30 min（功率 500 W，频率 40 kHz），滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取土大黄苷对照品，加甲醇制成0.1 g／L溶液，作为对照品溶液（临用新制）。按处方比例、工艺制备的不含大黄药材的阴性样品1 g，同供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。取土大黄替代处方中大黄，然后取按处方比例、工艺所制备的阳性样品1 g，同供试品溶液制备方法制成阳性对照品溶液。照 TLC法（2015年版《中国药典（四部）》通则 0502）试验，上述4种溶液各吸取1 μL，分别点于同一聚酰胺薄层板上，展开剂为三氯甲烷－甲醇－甲酸－水（11∶3∶0.2 ∶0.3），展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与土大黄苷对照品溶液色谱相应位置上未出现相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。阳性对照品溶液色谱中，在与土大黄苷对照品溶液色谱相应位置上出现相同颜色的斑点。详见图4。

图3 甘草的薄层色谱图

图4 土大黄苷的薄层色谱图

2.3 含量测定[12－15]

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent 5 TC －C18（2）柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 － 0.1% 磷酸溶液（68 ∶32）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃ ；进样量：10 μL。在此条件下，供试品溶液中大黄素色谱峰、大黄酚色谱峰与其他杂质峰基线分离。色谱图见图5。

2.3.2 溶液制备

对照品溶液：取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成大黄素质量浓度为10 μg／mL、大黄酚质量浓度为20 μg／mL的混合溶液，即得。

供试品溶液：取样品混匀的内容物约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，加热回流45 min，冷却至室温，用甲醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液10 mL，置具塞锥形瓶中，蒸干，冷却，加入8%盐酸溶液10 mL，1 h沸水浴加热，冷却至室温，转移至分液漏斗中，用50 mL乙酸乙酯分次提取5次，合并乙酸乙酯液，蒸干，用甲醇溶解残渣转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

图5 高效液相色谱图

阴性对照品溶液：精密称取按供试品处方比例、工艺制备的不含大黄的阴性样品0.8 g，按供试品溶液制备方法制成，即得。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取大黄素（11.70 μg ／mL）、大黄酚（19.58 μg ／mL）混合对照品溶液 2，5，10，15，20，25 μL，按拟订色谱条件测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得大黄素回归方程 Y＝3 798.28 X＋ 271.54，r＝1.000 0（n＝6）；得大黄酚回归方程 Y＝5 496.76 X＋4 577.04，r＝1.000 0（n＝6）。结果表明，大黄素和大黄酚进样量分别在 0.023 4～0.292 5 μg 和 0.039 16～0.489 60 μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

精密度试验：精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，进样6次。结果大黄素峰面积积分值的 RSD为0.49%（n＝6），大黄酚峰面积积分值的 RSD 为 0.85% （n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为6B02）样品，精密称取 6份，每份0.8 g，依法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，测定。结果大黄素平均含量为 0.413 2 mg ／g，RSD 为 1.57% （n＝6），大黄酚平均含量为 0.664 3 mg／g，RSD为1.81%（n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，每隔2 h进样1次，记录24 h。结果大黄素峰面积的 RSD为0.34%，大黄酸峰面积的 RSD为0.19%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为6B02，大黄素含量为 0.413 2 mg ／g，大黄酚含量为 0.664 3 mg ／g）6份，精密称定，每份0.4 g，分别精密加入25 mL大黄素、大黄酚混合对照品甲醇溶液（大黄素质量浓度为7.656 μg ／mL，大黄酚质量浓度为 11.088 μg ／mL），依法制备供试品溶液，测定。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2.3.4 样品含量测定

按拟订色谱条件，取3批（批号分别为6B01，6B02，6B03）样品，依法制备供试品溶液，精密吸取 10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg／粒，n＝2）

3 讨论

现行标准对大黄的薄层鉴别只是以大黄酸、大黄酚对照品为检验指标，且供试品溶液色谱中大黄酸对照品斑点不清晰，对结果的判定有一定影响。本研究中增加了大黄对照药材作为检验指标，以含量测定项下的供试品溶液作为该鉴别项的供试品溶液，优化了薄层鉴别展开系统，考察了不同温度、相对湿度下薄层色谱的展开情况，结果斑点 Rf值适宜，方法耐用性良好。

对大黄素和大黄酚的总量测定，本研究中考察了提取方式、提取时间和水解时间，发现超声处理45 min提取，沸水浴1 h水解，即可提取完全；水解后提取溶剂，比较了三氯甲烷、乙酸乙酯和乙醚3种溶剂，结果发现乙酸乙酯与三氯甲烷提取率相当，其供试品溶液色谱图中预测定峰与其他成分能达到基线分离，因此提取溶剂采用毒性较小的乙酸乙酯。