百合中乐果等3种农药残留的气相色谱－串联质谱法一测多评研究

陈 波 ，高 羽 ，余敏灵 ，朱敏凤

（1.四川省成都市妇女儿童中心医院，四川 成都 610000； 2.四川省乐山市食品药品检验检测中心，四川 乐山 614000）

中药材种植及中药饮片加工储存过程中农药的不当使用，均会影响中药饮片质量，危害人体健康[1]。2015年版《中国药典（四部）》收载了多种有机磷农药残留的气相色谱检查方法[2]。近年来，农药残留研究多以气相色谱、液相色谱或其与质谱的联用为主[3－5]。本研究中根据色谱保留时间和质荷比信息对样品进行定性分析，以乐果二级离子扫描色谱峰（125／79）面积为参照，计算其与敌敌畏二级离子扫描色谱峰（185／93）面积和毒死蜱二级离子扫描色谱峰（313.9／257.9）面积的校正因子，建立定量准确测定百合[6]中乐果等3种农药残留的一测多评方法，以期为测定农药残留量提供一测多评[7－11]研究思路。现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 材料

敌敌畏、乐果、毒死蜱标准品溶液（批号分别为GSB05－2298－2016， GSB05－2286－2016， GSB05－1849－2016），均为农业部环境监测保护研究所提供，规格均为100 μg／mL；乙腈、丙酮（北京百灵威科技有限公司）均为色谱纯；氯化钠、无水硫酸钠（成都市科龙化工试剂厂）均为优级纯；百合样品（四川龙马药业有限公司，批号分别为 20160516，20160721，20170815），由乐山市食品药品检验检测中心朱敏凤主管中药师鉴定为 Brown var.viridulum Bak的干燥肉质鳞叶（百合Liliumbrownii F.E.），符合 2015年版《中国药典（一部）》规定。

1.2 仪器

GCMS－TQ8030气质联用仪（岛津中国科技有限公司）；GC －MS／MS 7008 气质联用仪（美国 Agilent公司）；TSQ 8000气质联用仪（美国赛默飞世尔科技公司）。色谱柱 1：Rxi－ 5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛细管柱（岛津中国科技有限公司）；色谱柱 2：Rxi－5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛细管柱（美国 Agilent公司）；色谱柱 3：Rxi－ 5SilMS，30 m ×0.25 mm，0.25 μm 毛细管柱（美国 Restek公司）。电子天平（德国 Satorius公司）；Cleanert TPH净化柱（天津博纳艾洁尔公司）。

2 方法与结果

2.1 测定原理

利用样品色谱图中被测定物质色谱峰相对保留时间进行定位[2]和图谱中二级离子碎片峰[乐果为47，62，79碎片离子峰（丰度比为 155∶13∶100，以 79为参比）、敌敌畏为 63，93，109（丰度比为 24 ∶100 ∶25，以 93为参比、毒死蜱为 194，258，286（丰度比为 24 ∶100 ∶49，以258为参比）]对乐果、敌敌畏、毒死蜱色谱峰进行定性分析。精密量取乐果、敌敌畏、毒死蜱标准品溶液各适量，配制成不同质量浓度的混合溶液，按设定条件进样，记录色谱图，绘制乐果、敌敌畏、毒死蜱进样量对其峰面积的回归曲线，以乐果回归曲线斜率与敌敌畏、毒死蜱回归曲线斜率的比计算校正因子（fsk＝Ks／Kk），通过乐果回归曲线计算乐果含量，通过校正因子及乐果回归曲线计算敌敌畏、毒死蜱含量[2]进行定量分析。

2.2 溶液制备

取各标准品溶液，用丙酮稀配置成每1 mL含乐果、敌敌畏、毒死蜱各10 μg的溶液，作为标准品对照贮备液。取百合（批号为20160516）约50 g，粉碎过三号筛，称取1.732 4 g，精密称定，置50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，匀浆（15 000 r／min）提取 1 min，加入 2.5 g 氯化钠，匀浆提取 1 min，离心（4 200 r／min）5 min，上清液置150 mL鸡心瓶中，离心管中加入15 mL乙腈，按上述方法匀浆提取1次，合并提取液，40℃水浴旋转蒸发至约1 mL。加入约2 cm高无水硫酸钠于Cleanert TPH固相萃取柱上，用正己烷－丙酮（6∶4）预洗10 mL，将浓缩液移入柱中，用正己烷－丙酮（6∶4）25 mL洗脱，洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干，用丙酮稀释至1 mL，用0.2 μm滤膜过滤，即得供试品溶液；除称取样品外，按上述方法制备空白溶液。取供试品溶液制备项下百合粉末1.021 3 g，精密称定，同法从“置50 mL离心管中起到收集洗脱液于40℃水浴旋转浓缩至近干”转移至 1 mL容量瓶中，加5 μL标准贮备溶液，用丙酮稀释至刻度，摇匀，用 0.2 μm滤膜过滤，即得样品加标溶液。

2.3 测定条件

2.3.1 气相色谱条件

色谱柱：Rxi－5SilMS毛细管柱（30 m ×0.25 mm，0.25 μm）；线速度：47.2 cm ／s；进样口温度：250 ℃ ；程序升温：50℃保持1 min，以25℃ ／min速率升至125℃，再以10℃ ／min速率升至300℃，保持 15 min；进样体积：1 μL；载气：氦气（纯度大于 99.999% ）。

2.3.2 质谱条件

接口温度：250℃；离子源温度：200℃；溶剂延迟时间：5 min；碰撞气：氩气（纯度大于99.999%）。碰撞电压设置和检测离子选择：敌敌畏母离子为185.0（碰撞电压70 eV），子离子分别为93.0（碰撞电压14 eV）、109.0（碰撞电压 14 eV）、63.0（碰撞电压 22 eV）；乐果母离子为125.0（碰撞电压70 eV），子离子分别为79.0（碰撞电压 8 eV）、47.0（碰撞电压 14 eV）、62.0（碰撞电压 10 eV）；毒死蜱母离子为313.9（碰撞电压70 eV），子离子分别为 257.9（碰撞电压 14 eV）、285.9（碰撞电压 8 eV）、193.9（碰撞电压 28 eV）。

2.4 图谱解析

精密量取标准品贮备溶液50 μL，置1 mL容量瓶中，加丙酮定容，作为对照品溶液。按2.3.1项下色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液、样品加标溶液、空白溶液分别进样，记录色谱图。结果在对照品溶液二级离子扫描色谱图中，有敌敌畏二级离子扫描峰（185／93）、乐果二级离子扫描峰（125／79）和毒死蜱二级离子扫描峰（313.9／257.9）， 保 留 时 间 分 别 为 5.690， 10.663，13.191 min，在空白溶液色谱和供试品溶液色谱中无上述色谱峰，在样品加标溶液色谱中有和对照品溶液色谱保留时间一致的敌敌畏、乐果和毒死蜱二级离子扫描色谱峰，详见图1。对照品溶液和样品加标溶液的二级离子碎片图谱中敌敌畏在 63，93，109 处（丰度比为 24 ∶100 ∶25），乐果在 47，62，79 处（丰度比为 155 ∶13 ∶100），毒死蜱在194，258，286 处（丰度比为 24 ∶100 ∶49），有二级离子碎片峰，详见图2。

2.5 方法学考察

线性关系考察：精密量取标准品贮备溶液10，20，40，50，60，80，100 μL，分别置 7 个 1 mL 容量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，按2.3.1项下色谱条件测定。以各组分二级离子扫描峰面积（A）与进样量（m，ng）进行线性回归，得回归方程。结果见表1。

f值和 t值测定与耐受性考察：校正因子 f敌／乐＝2 016 535 ／615 311＝3.277 3，f毒／乐＝1 278 304／615 311 ＝2.077 5；相对保留时间 t敌／乐＝5.690／10.663＝0.533 6，t毒／乐＝13.191／10.663＝1.237 1。实际应用中，色谱仪、色谱柱、色谱条件的变化可能引起 f值变化，因此对不同仪器、不同色谱柱、线速度、进样体积可能影响 f值的因素进行考察，结果表明，f值的波动不大。详见表2。

表1 线性关系考察、精密度、重复性、稳定性试验及检出限确定结果

图1 二级离子扫描色谱图

精密度试验：精密量取标准品贮备溶液40 μL，置1 mL容量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按2.3.1项下色谱条件重复进样6次。结果见表1。

重复性试验：精密量取标准品贮备溶液40 μL，分别置6个 1 mL容量瓶，加丙酮稀释至刻度，摇匀。按2.3.1项下色谱条件分别进样。结果见表1。

稳定性试验：取2.4项下样品加标溶液，按2.3项下测定条件分别在 0，2，4，8，12，14，16，20，24 h 时进样，结果乐果、敌敌畏、毒死蜱色谱峰峰面积变化不大。结果见表1。

图2 二级离子碎片图谱

表2 相对校正因子耐受性考察结果

检出限确定：取2.4项下样品加标溶液，按2.3.1项下色谱条件测定，测得信噪比（S／N），以3倍 S／N计算检出限、10倍 S／N计算定量限。结果见表1。

加样回收试验：取2.2项下样品粉末9份，每份约1 g，精密称定，分别置9个50 mL离心管中，分为3组，每组3份，第1组中每份加标准品贮备溶液40 μL，第2组中每份加标准品贮备溶液50 μL，第3组中每份加标准品贮备溶液60 μL，依法制备样品溶液，取样品溶液按2.3.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，按回归方程计算含量。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n＝9）

2.6 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 20160516，20160721，20170815）样品，各20 g，粉碎过三号筛，分别取约1 g，精密称定，按2.2项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液按2.3.1项下色谱条件分别进样，记录色谱图，按加样回收试验方法计算含量。结果3批样品中敌敌畏、乐果、毒死蜱残留量均为0。

3 讨论

本研究证实了可以采用GC－MS／MS测定百合中乐果等3种农药残留，对采用GC－MS／MS法测定样品中物质含量提供了一测多评、数字对照品等的试验设计思路。一测多评法是以一种对照品，建立该成分与其他成分间的相对响应因子，通过相对响应因子来计算其他成分含量的一种质量控制方法，具有成本低、效率高等优点，能有效解决多指标质量控制面临的对照品短缺、不易获得和检测成本相对昂贵等问题。在试验中，对多种药材农药残留的含量测定进行了研究，发现由于中药材含有多种成分，某些成分对测定会有一些干扰，故在测定具体某一品种时应设计具体的试验参数，并进行相应方法学论证。

当色谱条件有细微改变时，相对保留时间有细微变化，但在本试验中，被测定物质的定性主要采用二级离子碎片峰及其丰度比确认，故对相对保留时间的耐受性没有进行考察。

仪器厂家建议进样体积不超过1 μL，在相对校正因子 f值耐受性考察时，对进样体积 0.9，1.0，1.1 μL时的 f进行了比较，结果变化不大。

因乙腈对农药溶解度较大，可溶入的杂质量适中，故选择乙腈为提取液；在Cleanert TPH固相萃取柱上加入约2 cm高无水硫酸钠以除去样品溶液及洗脱液中的水分。

质谱分析检测限可达 10－15～10－12mol数量级，适合于农药残留的检测，在定性分析时采用色谱－串联质谱，电子轰击离子化比较待测化合物质谱图谱确定化合物的成分。

GC －MS联用法和 GC －串联 MS（MS／MS）联用法既具有GC的高分离效能，又具有MS可鉴定化合物结构的特点，可同时快速测定样品中多种残留农药及其衍生物。