用酵母菌进行“微生物的实验室培养”实验

2018-11-08 06:23杨明娴杜玉芬
生物学通报 2018年1期
关键词:保种划线菌液

杨明娴 杜玉芬

(1 北京市第十四中学 北京 100055 2 北京教育学院宣武分院 北京 100053)

实验是生物学教学的重要内容和基本手段,实验材料的选择是否恰当、安全,实验结果是否理想,是否有利于课堂教学目标的有效达成,是中学实验教学的重要原则之一。人教版高中生物学选修1《生物技术实践》模块中设置了“微生物的实验室培养”这一实验课题。教材以采用大肠杆菌作为实验材料,对大肠杆菌进行分离纯化,希望学生熟练掌握微生物培养的相关实验技能。作为高中实验,该实验基本上是一学年进行一次,实验材料大肠杆菌菌种不像大学实验室常年均可获得,若不进行保种,每年开展实验均需要从生物公司专门购买菌种,费用较高,存在实验材料不易获取且实验经费较高等问题。特别是所用大肠杆菌菌种虽说是安全菌种,但作为细菌,在高中实验室开展此实验,对于师生的安全性都存在一定的挑战。鉴于此,对该实验材料进行了改进优化,用酵母菌作为实验材料,取代传统的大肠杆菌,能完成教材中要求的相关实验内容,且实验效果非常理想。改进后的实验安全性极大提高,实验材料简单易得,较大程度降低了实验成本。

1 实验材料及设备

1)安琪高活性干酵母、土豆、葡萄糖、琼脂、孟加拉红培养基、75%酒精、蒸馏水。

2)接种环、玻璃涂布器、培养皿、锥形瓶、试管、试管架、胶塞、烧杯、量筒、玻璃棒、微量移液器、移液器吸头、封口膜、橡皮筋、称量纸、药勺、酒精灯、火柴、记号笔。

3)电子天平、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、摇床、恒温培养箱、微波炉、超净工作台(可用酒精灯代替)。

2 实验方法

2.1 试剂的配制

1)5%的葡萄糖溶液:称取5g葡萄糖,溶于100 mL蒸馏水中。

2)马铃薯液体培养基:土豆去皮后称取200 g,切成小块放入锅中,加水1 000 mL,加热煮沸,煮至土豆软烂,用纱布过滤取汁,再加入20 g葡萄糖溶解,用蒸馏水定容至1 000 mL。

3)马铃薯琼脂培养基:在上述马铃薯液体培养基的基础上,加入1.5%的琼脂粉(琼脂粉因生产厂家不同其强度不同,可根据实际情况适当调整比例)。

4)孟加拉红培养基:按如下配方配制,也可直接购买成品:蛋白胨 5 g;葡萄糖 10 g;磷酸二氢钾 1 g;硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g;琼脂 15 g;1/3000孟加拉红溶液100 mL;蒸馏水1 000 mL;氯霉素0.1 g

以上试剂均需高压蒸汽灭菌(压力103 kPa,温度121℃)后方可使用。本实验所需的其他物品也均需高压蒸汽灭菌。

2.2 实验步骤 实验步骤按照图1流程开展。

2.2.1 实验准备 准备实验所需物品、配制相关试剂及培养基(见2.1试剂的配制)并灭菌。待灭好菌的培养基冷却至50℃左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。

图1 实验流程

2.2.2 酵母菌的活化 在酒精灯火焰旁打开袋装安琪高活性干酵母,取少量酵母粉末加入至已灭菌的5%葡萄糖溶液中,置于28℃摇床上震荡培养活化3~10 h(培养时间可根据接种量的多少适当调整),也可直接采用室温活化,观察锥形瓶中酵母菌培养液浑浊度的变化,待液体浑浊时即可。

2.2.3 酵母菌的显微镜观察 在酒精灯火焰前取适量活化后的酵母菌,制作临时装片,在显微镜下镜检,观察酵母菌形态。

2.2.4 接种

1)平板划线法接种。在酒精灯火焰旁,用已灼烧灭菌并冷却后的接种环,蘸取一环菌液,在培养基上划3~5条平行线,然后灼烧接种环,冷却,从第1区域划线的末端开始往第2区域内划线。重复以上操作,注意不要将最后一区的划线与第1区相连(也可采用连续“之”字划线法接种)。做好标记,置于28℃恒温培养箱中倒置培养24~48 h,观察实验结果,观察是否出现单菌落,并记录菌落的颜色、形状、大小等特征。

2)稀释涂布平板法接种。将酵母菌菌液进行梯度稀释(101~106),用微量移液器移取 100 μL 106倍稀释的菌液,接种到培养基表面(接种选取的稀释倍数可根据情况适当调整),用灭菌的玻璃涂布器涂布均匀。做好标记,置于28℃恒温培养箱中培养24~48 h,观察实验结果。

2.2.5 纯化 无菌挑取分离得到的单菌落,并接种于马铃薯液体培养基中,放在28℃摇床上震荡培养8~12 h,待培养液浑浊浑浊度适当时停止培养,即可得到酵母菌的纯培养液。

2.2.6 初步鉴别 将酵母菌菌液接种到孟加拉红琼脂培养基中,酵母菌呈现红色菌落。

2.2.7 保种 取酵母菌纯培养液800 μL于1.5 mL的无菌离心管中,加200 μL无菌甘油,混匀,冷冻保存。

3 实验结果与讨论

3.1 酵母菌的活化 采用不同的活化方式与活化时间,酵母菌活化结果见表1。

表1 酵母菌的活化

由表1可知,15℃室温活化1 h与 28℃恒温振荡活化1 h并无太大区别,而恒温振荡活化7 h酵母菌数量明显上升,可达1.6×1010个/mL,在真正开展此实验时,可根据实际情况选择合适的活化方式与时间。15℃室温活化1 h即可保证实验教学的需求。所以,在进行实验教学时,完全可采用最简便的室温活化方式进行。

3.2 酵母菌的显微镜观察 用显微镜镜检可观察到活化了的酵母菌,具有细胞典型的形态,并有一定的折光度,在视野中还可捕捉到正在进行出芽生殖的酵母菌(图2)。

图2 酵母菌的显微镜镜检结果(放大倍数10×40)

3.3 接种

3.3.1 平板划线法接种 平板划线法采用教材中的分区划线,以及连续划“之”字的方式分别接种,2种接种方法均可分离得到单个菌落(图3)。

图3 平板划线法接种酵母菌(左:分区划线 右:连续划线)

3.3.2 稀释涂布平板法接种 本实验中,酵母菌菌液采用28℃恒温振荡活化7 h的菌液,由实验结果(图4)可知,107倍稀释的菌液在本实验中是较理想的稀释度,重复实验计数结果显示,该稀释度下酵母菌菌落数为160个,在30~300个范围内,符合微生物的计数要求,换算得到酵母菌菌液的浓度为 1.6×1010个/mL。

图4 稀释涂布平板法接种酵母菌

酵母菌接种实验结果,无论是平板划线法还是稀释涂布平板法,均可分离得到单个菌落,与大肠杆菌菌落形态类似,且均较为规则,边缘较整齐,不同于大肠杆菌的是酵母菌菌落通常比较鼓,有突起,大肠杆菌菌落则相对比较平整,这也可作为菌种初步鉴别的一个依据。此外,酵母菌培养时间也相对较快,一般培养24 h后,菌落形态就明显可见,在开展教学时,第1天做实验,第2天观察结果,课时衔接非常顺利,即便是多培养2天,实验结果也不会有太大影响,菌落更大反而更便于观察。

3.4 纯化 用无菌接种环或无菌牙签挑取一个单菌落,并接种于马铃薯液体培养基中,放在28℃摇床上振荡培养,获取酵母菌的纯培养液。

3.5 初步鉴别 教材中对大肠杆菌的初步鉴别采用伊红美蓝琼脂培养基,在该培养基上大肠杆菌呈现金属光泽。查阅文献发现孟加拉红培养基可用于酵母菌的初步鉴别。酵母菌在该培养基上会呈现出红色菌落(图5)。

图5 酵母菌的初步鉴别

3.6 保种 为使实验课题相对比较完整,以及让学生了解微生物培养中保种的方法和意义,又进行了保种的操作,将纯化后的酵母菌菌液800 μL与200 μL无菌甘油混匀,-20℃冷冻保存即可。其实,在实际操作中完全可省略此环节。酵母菌的活化非常方便,只要在开展实验前,购买一袋安琪高活性干酵母,用5%葡萄糖溶液室温活化1~3 h即可,随用随活化,免去了以大肠杆菌为实验材料必须每年保种的繁琐。

4 实验改进后的优点

4.1 实验安全性极大提高 以酵母菌作为实验材料,取代传统的大肠杆菌,改进后的实验材料菌种来源于生活中食用干酵母,相比大肠杆菌安全性方面极大提高,保证了师生的实验安全。

4.2 实验材料简单易得 原教材中必须有大肠杆菌菌种才可进行实验,且每年都需进行保种,否则无法维持实验教学的运转,若保存不当还会出现无法开展实验的不利局面。而酵母菌菌种的获取非常方便,只需在开展实验时买一袋干酵母,用适量已灭菌的5%葡萄糖溶液活化即可获取酵母菌菌种,且无需保种,可随时活化。此外,本实验需用土豆配制培养基,所用实验材料都贴近生活、价格便宜,也便于学生接受,符合学生的认知。

4.3 极大程度降低了实验成本 对原实验和改进实验所需成本进行比较,按照1 L培养基用量,每升培养基可倒约50~60个平板,能满足一个班级分组实验的使用量,仅1个教学班就可节省150多元,平行班越多,节约的成本也越多。

总之,用酵母菌作为实验材料,取代传统的大肠杆菌,能完成教材中“微生物的实验室培养”要求的所有实验内容,且实验效果非常理想,成本较低,可作为实验教学的推广。

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