用酵母菌进行“微生物的实验室培养”实验

杨明娴 杜玉芬

（1 北京市第十四中学 北京 100055 2 北京教育学院宣武分院 北京 100053）

实验是生物学教学的重要内容和基本手段，实验材料的选择是否恰当、安全，实验结果是否理想，是否有利于课堂教学目标的有效达成，是中学实验教学的重要原则之一。人教版高中生物学选修1《生物技术实践》模块中设置了“微生物的实验室培养”这一实验课题。教材以采用大肠杆菌作为实验材料，对大肠杆菌进行分离纯化，希望学生熟练掌握微生物培养的相关实验技能。作为高中实验，该实验基本上是一学年进行一次，实验材料大肠杆菌菌种不像大学实验室常年均可获得，若不进行保种，每年开展实验均需要从生物公司专门购买菌种，费用较高，存在实验材料不易获取且实验经费较高等问题。特别是所用大肠杆菌菌种虽说是安全菌种，但作为细菌，在高中实验室开展此实验，对于师生的安全性都存在一定的挑战。鉴于此，对该实验材料进行了改进优化，用酵母菌作为实验材料，取代传统的大肠杆菌，能完成教材中要求的相关实验内容，且实验效果非常理想。改进后的实验安全性极大提高，实验材料简单易得，较大程度降低了实验成本。

1 实验材料及设备

1）安琪高活性干酵母、土豆、葡萄糖、琼脂、孟加拉红培养基、75%酒精、蒸馏水。

2）接种环、玻璃涂布器、培养皿、锥形瓶、试管、试管架、胶塞、烧杯、量筒、玻璃棒、微量移液器、移液器吸头、封口膜、橡皮筋、称量纸、药勺、酒精灯、火柴、记号笔。

3）电子天平、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、摇床、恒温培养箱、微波炉、超净工作台（可用酒精灯代替）。

2 实验方法

2.1 试剂的配制

1）5%的葡萄糖溶液：称取5g葡萄糖，溶于100 mL蒸馏水中。

2）马铃薯液体培养基：土豆去皮后称取200 g，切成小块放入锅中，加水1 000 mL，加热煮沸，煮至土豆软烂，用纱布过滤取汁，再加入20 g葡萄糖溶解，用蒸馏水定容至1 000 mL。

3）马铃薯琼脂培养基：在上述马铃薯液体培养基的基础上，加入1.5%的琼脂粉（琼脂粉因生产厂家不同其强度不同，可根据实际情况适当调整比例）。

4）孟加拉红培养基：按如下配方配制，也可直接购买成品：蛋白胨 5 g；葡萄糖 10 g；磷酸二氢钾 1 g；硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g；琼脂 15 g；1/3000孟加拉红溶液100 mL；蒸馏水1 000 mL；氯霉素0.1 g

以上试剂均需高压蒸汽灭菌（压力103 kPa，温度121℃）后方可使用。本实验所需的其他物品也均需高压蒸汽灭菌。

2.2 实验步骤 实验步骤按照图1流程开展。

2.2.1 实验准备 准备实验所需物品、配制相关试剂及培养基（见2.1试剂的配制）并灭菌。待灭好菌的培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。

图1 实验流程

2.2.2 酵母菌的活化 在酒精灯火焰旁打开袋装安琪高活性干酵母，取少量酵母粉末加入至已灭菌的5%葡萄糖溶液中，置于28℃摇床上震荡培养活化3～10 h（培养时间可根据接种量的多少适当调整），也可直接采用室温活化，观察锥形瓶中酵母菌培养液浑浊度的变化，待液体浑浊时即可。

2.2.3 酵母菌的显微镜观察 在酒精灯火焰前取适量活化后的酵母菌，制作临时装片，在显微镜下镜检，观察酵母菌形态。

2.2.4 接种

1）平板划线法接种。在酒精灯火焰旁，用已灼烧灭菌并冷却后的接种环，蘸取一环菌液，在培养基上划3～5条平行线，然后灼烧接种环，冷却，从第1区域划线的末端开始往第2区域内划线。重复以上操作，注意不要将最后一区的划线与第1区相连（也可采用连续“之”字划线法接种）。做好标记，置于28℃恒温培养箱中倒置培养24～48 h，观察实验结果，观察是否出现单菌落，并记录菌落的颜色、形状、大小等特征。

2）稀释涂布平板法接种。将酵母菌菌液进行梯度稀释（101～106），用微量移液器移取 100 μL 106倍稀释的菌液，接种到培养基表面（接种选取的稀释倍数可根据情况适当调整），用灭菌的玻璃涂布器涂布均匀。做好标记，置于28℃恒温培养箱中培养24～48 h，观察实验结果。

2.2.5 纯化 无菌挑取分离得到的单菌落，并接种于马铃薯液体培养基中，放在28℃摇床上震荡培养8～12 h，待培养液浑浊浑浊度适当时停止培养，即可得到酵母菌的纯培养液。

2.2.6 初步鉴别 将酵母菌菌液接种到孟加拉红琼脂培养基中，酵母菌呈现红色菌落。

2.2.7 保种 取酵母菌纯培养液800 μL于1.5 mL的无菌离心管中，加200 μL无菌甘油，混匀，冷冻保存。

3 实验结果与讨论

3.1 酵母菌的活化 采用不同的活化方式与活化时间，酵母菌活化结果见表1。

表1 酵母菌的活化

由表1可知，15℃室温活化1 h与 28℃恒温振荡活化1 h并无太大区别，而恒温振荡活化7 h酵母菌数量明显上升，可达1.6×1010个/mL，在真正开展此实验时，可根据实际情况选择合适的活化方式与时间。15℃室温活化1 h即可保证实验教学的需求。所以，在进行实验教学时，完全可采用最简便的室温活化方式进行。

3.2 酵母菌的显微镜观察 用显微镜镜检可观察到活化了的酵母菌，具有细胞典型的形态，并有一定的折光度，在视野中还可捕捉到正在进行出芽生殖的酵母菌（图2）。

图2 酵母菌的显微镜镜检结果（放大倍数10×40）

3.3 接种

3.3.1 平板划线法接种 平板划线法采用教材中的分区划线，以及连续划“之”字的方式分别接种，2种接种方法均可分离得到单个菌落（图3）。

图3 平板划线法接种酵母菌（左：分区划线 右：连续划线）

3.3.2 稀释涂布平板法接种 本实验中，酵母菌菌液采用28℃恒温振荡活化7 h的菌液，由实验结果（图4）可知，107倍稀释的菌液在本实验中是较理想的稀释度，重复实验计数结果显示，该稀释度下酵母菌菌落数为160个，在30～300个范围内，符合微生物的计数要求，换算得到酵母菌菌液的浓度为 1.6×1010个/mL。

图4 稀释涂布平板法接种酵母菌

酵母菌接种实验结果，无论是平板划线法还是稀释涂布平板法，均可分离得到单个菌落，与大肠杆菌菌落形态类似，且均较为规则，边缘较整齐，不同于大肠杆菌的是酵母菌菌落通常比较鼓，有突起，大肠杆菌菌落则相对比较平整，这也可作为菌种初步鉴别的一个依据。此外，酵母菌培养时间也相对较快，一般培养24 h后，菌落形态就明显可见，在开展教学时，第1天做实验，第2天观察结果，课时衔接非常顺利，即便是多培养2天，实验结果也不会有太大影响，菌落更大反而更便于观察。

3.4 纯化 用无菌接种环或无菌牙签挑取一个单菌落，并接种于马铃薯液体培养基中，放在28℃摇床上振荡培养，获取酵母菌的纯培养液。

3.5 初步鉴别 教材中对大肠杆菌的初步鉴别采用伊红美蓝琼脂培养基，在该培养基上大肠杆菌呈现金属光泽。查阅文献发现孟加拉红培养基可用于酵母菌的初步鉴别。酵母菌在该培养基上会呈现出红色菌落（图5）。

图5 酵母菌的初步鉴别

3.6 保种 为使实验课题相对比较完整，以及让学生了解微生物培养中保种的方法和意义，又进行了保种的操作，将纯化后的酵母菌菌液800 μL与200 μL无菌甘油混匀，-20℃冷冻保存即可。其实，在实际操作中完全可省略此环节。酵母菌的活化非常方便，只要在开展实验前，购买一袋安琪高活性干酵母，用5%葡萄糖溶液室温活化1～3 h即可，随用随活化，免去了以大肠杆菌为实验材料必须每年保种的繁琐。

4 实验改进后的优点

4.1 实验安全性极大提高 以酵母菌作为实验材料，取代传统的大肠杆菌，改进后的实验材料菌种来源于生活中食用干酵母，相比大肠杆菌安全性方面极大提高，保证了师生的实验安全。

4.2 实验材料简单易得 原教材中必须有大肠杆菌菌种才可进行实验，且每年都需进行保种，否则无法维持实验教学的运转，若保存不当还会出现无法开展实验的不利局面。而酵母菌菌种的获取非常方便，只需在开展实验时买一袋干酵母，用适量已灭菌的5%葡萄糖溶液活化即可获取酵母菌菌种，且无需保种，可随时活化。此外，本实验需用土豆配制培养基，所用实验材料都贴近生活、价格便宜，也便于学生接受，符合学生的认知。

4.3 极大程度降低了实验成本 对原实验和改进实验所需成本进行比较，按照1 L培养基用量，每升培养基可倒约50～60个平板，能满足一个班级分组实验的使用量，仅1个教学班就可节省150多元，平行班越多，节约的成本也越多。

总之，用酵母菌作为实验材料，取代传统的大肠杆菌，能完成教材中“微生物的实验室培养”要求的所有实验内容，且实验效果非常理想，成本较低，可作为实验教学的推广。