褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

高慧新， 封 毅， 王孝勋， 吴燕春， 戴忠华， 田 慧

(广西中医药大学，广西南宁 530200)

褐苞薯蓣来源于薯蓣科薯蓣属植物褐苞薯蓣(DioscoreapersimilisPrain et Burkill)，别称广山药、广西淮山，根茎入药，主产于广西桂平、玉林、灵山、陆川、平南等地，野生于海拔100～1 950 m的山坡、路旁、山谷杂木或灌丛中，我国南方各地也均有栽培。中医用其“补脾养胃，生津益肺，补肾涩精”；壮医用其“调谷道气道水道，补肺肾”[1]。褐苞薯蓣在广西、福建、海南等地被作为山药地区习用品，药用与食用由来已久[2]。有研究发现，褐苞薯蓣乙醇提取物各萃取层(石油醚层、乙酸乙酯层和正丁醇层)均表现出较好的抗炎和免疫调节活性[3]。褐苞薯蓣产量大，适应能力强，占领了药材和食品市场上很重要的部分，是一种重要的药用植物资源，有研究的必要性。

ISSR即简单重复序列间扩增(inter simple sequence repeat)，是近年应用较多的一种新型DNA分子标记技术，它以微卫星重复序列为引物，通常为16～18个碱基序列，由 1～4 个碱基组成的串联重复序列和几个非重复的锚定碱基组成，提高了PCR扩增反应的专一性。同时ISSR标记以其较低的成本、良好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点，被视为理想的遗传标记方法[4]。ISSR-PCR反应易受多种因素的影响，本试验利用单因素结合正交设计的方法，旨在建立适合于褐苞薯蓣 ISSR-PCR 反应的最佳体系，为褐苞薯蓣种质资源遗传多态性的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 试验材料为褐苞薯蓣新鲜叶片，采自广西中医药大学仙葫校区，并由广西中医药大学药用植物教研室梁子宁副教授鉴定为薯蓣科薯蓣属植物褐苞薯蓣(DioscoreapersimilisPrain et Burkill)。

1.1.2 试剂与仪器

1.1.2.1 试剂 新型植物基因组DNA提取试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA marker(D2000)、5×TBE均购自天根生化科技(北京)有限公司，琼脂糖(西班牙)，GelRed核酸染料(美国)，其他所用试剂均为国产分析纯，ISSR-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2.2 仪器 Eppendorf移液枪(德国)，电子分析天平(赛多利斯BSA224S)，超纯水机(法国MILIPORE)，涡旋混合器(上海滬西XW-80A)，高速冷冻离心机(德国Sigma Sartorius)，紫外分光光度计(日本岛津UV1780)，梯度PCR仪(Bio-red T100)，电泳仪(Bio-red)，凝胶成像系统(Bio-red，gel Doc EZ)

1.2 试验方法

1.2.1 褐苞薯蓣植物总DNA的提取 根据新型植物基因组DNA提取试剂盒的操作步骤对试验材料进行植物总DNA的提取，并采用琼脂糖电泳及紫外分光光度法检测总DNA的纯度及浓度，将其稀释至30 ng/μL备用。

1.2.2 单因素条件考察 参照文献[5-7]，设定本次试验ISSR-PCR基本反应体系组成为：总体积20 μL，TaqDNA聚合酶1.5 U，DNA模板量90 ng，dNTPs浓度 0.25 mmol/L，引物浓度0.5 μmol/L，Mg2+浓度1.5 mmol/L，10×Taqbuffer 2.0 μL，其余用ddH2O补齐。扩增程序为：95 ℃ 预变性 5 min；95 ℃变性40 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34个循坏；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。以初步筛选出的引物807(AGAGAGAGAGAGAGAGT)作为单因素及正交试验的引物。对影响ISSR-PCR反应体系的5个因素：TaqDNA聚合酶用量、DNA模板量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度分别设置6个浓度梯度，采取改变单一因素的方法，来确定该因素对ISSR-PCR的影响，各因素水平如表1所示。将PCR所得产物置于1%琼脂糖凝胶中，以电压75 V电泳50 min。使用凝胶成像系统观察并采集图像。

表1 单因素试验设计

1.2.3 正交试验设计 采用L16(45)正交试验设计，根据单因素试验结果分别确定5个相关因素的4个水平，共16个处理组(表2)。其基础反应体系和反应程序与单因素试验一致。

1.2.4 退火温度的优化 利用PCR，以引物807的Tm值(50±5) ℃为范围，自动生成8个温度梯度以优化退火温度。

表2 正交试验设计

2 结果与分析

2.1 Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR反应体系的影响

由图1可知，TaqDNA聚合酶用量在0.5、1.5 U时，均无条带；在1.0、2.5、3.0 U时，虽有条带，但并不清晰，且拖尾严重；在2.0 U时，条带清晰明亮，故体系中TaqDNA聚合酶用量应在2.0 U左右。

2.2 DNA模板量对ISSR-PCR反应体系的影响

由图2可知，DNA模板量在45、105、120 ng时均能显示清晰明亮的条带，在60～90 ng时，条带太亮不清晰，综合考虑到试验成本，故体系中的最佳DNA模板量应在45 ng左右，且不超过60 ng。

2.3 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

由图3可知，dNTPs的浓度为0.062 5、0.375 0 mmol/L时，扩增出的条带少、不清晰；浓度在0.125 0～0.312 5 mmol/L 时，扩增出的条带多且清晰稳定；故体系中dNTPs的浓度范围为0.125 0～0.312 5 mmol/L。

2.4 引物浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

由图4可知，随着引物浓度的增加，扩增条带也逐渐增强、清晰，在浓度达到0.625 μmol/L时，条带特异性减弱，引物二聚体增多；故设定体系中引物浓度范围为0.375 0～0.562 5 μmol/L。

2.5 Mg2+浓度对ISSR-PCR反应体系的影响

由图5可知，当Mg2+浓度为0.625、1.250 mmol/L时，扩增条带少；浓度为1.875 mmol/L时，扩增条带增多且明亮清晰；浓度再增大扩增条带模糊；故体系Mg2+浓度应在 1.875 mmol/L 左右。

2.6 正交试验

正交试验结果如图6所示，依据扩增条带的强弱和杂带的多少，对正交试验PCR结果进行直观分析。13号、15号和16号组合扩增条带太过明亮且背景弥散严重，不易辨识；11号、12号和14号组合扩增条带暗淡模糊，不易识别；1～10号组合扩增出的条带数量多且清晰明亮，其中8号组合扩增条带多且带形清晰明亮，重复试验发现其扩增效果稳定。故褐苞薯蓣ISSR-PCR最佳反应体系为：20 μL体系，其中10×TaqBuffer 2.0 μL，TaqDNA聚合酶1.875 U，DNA模板量52.5 ng，dNTPs浓度0.25 mmol/L，引物浓度0.437 5 μmol/L，Mg2+浓度 1.5 mmol/L，其余用ddH2O补齐。

2.7 退火温度的优化

将退火温度设定在45～55 ℃，PCR仪自动生成8个温度梯度：55.0、54.2、52.9、51.2、48.9、46.9、45.7、45.0 ℃。由图7可知，当温度在52.9、51.2 ℃时，条带数量相对较多且清晰，故本次试验采用52 ℃作为退火温度是合理的。

3 讨论与结论

本试验主要从影响PCR反应的TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTPs、引物、Mg2+为考察点，建立并优化褐苞薯蓣的ISSR-PCR体系。在PCR体系中，TaqDNA聚合酶浓度过高，会引起非特异性产物的扩增；模板DNA的纯度和用量都会对PCR扩增有影响；dNTPs浓度过高可加快反应速度，同时也增加碱基的错误掺入率和试验成本，低浓度的dNTPs会导致反应速率下降，但可提高试验准确性；引物是保证PCR特异性的关键因素，浓度偏高会引起错配和非特异性产物增加、引物之间易形成二聚体，浓度太低又可能得不到扩增结果或产量过低；最佳的Mg2+浓度对于不同的引物和模板都不相同，较高的浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实度。

本试验运用单因素结合正交设计的方法，首先确定各因素用量或浓度的有效范围，再利用正交设计进行优化组合，确立适用于褐苞薯蓣的ISSR-PCR反应体系。试验结果显示，5个因素对褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的影响大小为TaqDNA聚合酶>Mg2+>引物>DNA模板>dNTPs。

本试验选出的褐苞薯蓣最佳20 μL ISSR-PCR反应体系为：TaqDNA聚合酶1.875 U，DNA模板量52.5 ng，dNTPs浓度0.25 mmol/L，引物浓度0.437 5 μmol/L，Mg2+浓度 1.5 mmol/L，10×TaqBuffer 2.0 μL，其余用ddH2O补齐。