氯喹对肝癌小鼠肿瘤生长的影响及作用机制

周柯均 王 城 谢梦忆 张 灿 杨金凤 杨远波 蒲 娟

肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，约占人类肿瘤的6%，其发病率高，恶性程度高，浸润和转移性强，病死率仅次于胃癌和食道癌，严重威胁人们的生命健康和生活质量[1-2]。因其早期临床症状不明显，当患者出现症状时多数已达中晚期，且肝癌术后易复发，化疗后易产生耐药性，因此研究肝癌的发生机制并寻找有效的治疗手段迫在眉睫[3]。肝癌的发生发展是极其复杂的过程，多种分子信号通路参与了肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程。氯喹是一种治疗疟疾和类风湿的药物，同时也是一种常用的自噬抑制剂，可通过选择性抑制细胞酸性溶酶体的降解而抑制自噬，导致细胞死亡[4-5]。本研究通过建立HepG2小鼠肝癌肿瘤模型，探讨氯喹对肝癌小鼠肿瘤增殖的影响及其作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级实验用健康小鼠75只(购自北京维通利华实验动物有限公司，小鼠编号20171205)，雌雄各半，6～8周龄，体质量18～22 g，平均体质量(20.8±1.5)g。所有小鼠均饲养于SPF级屏障系统内。饲养条件：温度22～26℃，相对湿度40%～60%，所用饲料、饮用水和垫料等均经严格消毒灭菌并定期进行更换。

1.2 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院(上海)，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中(含1%青霉素和链霉素)，37℃，5%CO2恒温孵育箱中培养并传代。待细胞增长至1×107个时终止，PBS润洗，胰酶消化，经台盼蓝染色并显微镜下计数活细胞>90%，收集至1.5 mL EP管中。

1.3 HepG2肝癌移植瘤的建立与分组 将收集的HepG2肝癌细胞株(2×107/mL)直接腹腔接种到5只小鼠体内，7 d后小鼠腹腔产生大量腹水，在无菌条件下抽取3 mL小鼠腹水作为肿瘤源，并加入15 mL生理盐水进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×108/mL，分别取0.3 mL细胞悬液接种于75只小鼠右前肢腋部皮下，1～2 d后小鼠皮下即可长出瘤块。将75只小鼠随机分为对照组、低剂量氯喹处理组和高剂量氯喹处理组，每组各25只。氯喹处理组小鼠分别于建模后第2天开始腹腔注射氯喹(25 μmol/L和50 μmol/L)，对照组则注射生理盐水作为对照，连续处理16 d并密切观察小鼠存活状态。16 d后所有小鼠腹腔注射0.8%戊巴比妥(60 mg/kg)，待小鼠失去意识后处死，收集肿瘤标本并备用。

1.4 Western blot检测自噬相关蛋白表达 分别取3组小鼠肿瘤组织100 mg，加入300 μL组织裂解液充分裂解40 min后，14 000 r/min离心10 min，取上清液加入5倍对比液并于沸水中煮15 min，电泳及转膜结束后，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别用1∶1 000体积比稀释的LC3及P62抗体(美国abcam公司，编号ab37215和ab86225)4℃孵育过夜，次日PBS洗膜3次，然后用1∶5 000体积比稀释的羊抗兔二抗室温孵育2 h后PBS洗膜3次，显影液显影；蛋白表达定量分析用Image J图像分析软件对条带进行分析，内参采用β-actin。

1.5 免疫组化检测自噬发生情况 石蜡组织标本包埋后连续切片，固定于载玻片上，50℃烘箱中烘1 h后，二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇及75%乙醇依次进行水化，蒸馏水洗涤3次，然后置于柠檬酸钠溶液中加热2次，每次8 min，PBS洗涤3次，3% H2O2溶液中浸10 min，PBS洗涤3次后，滴加LC3和P62抗体稀释液，4℃孵育过夜。PBS洗涤3次后用羊抗兔二抗室温孵育1 h，PBS洗涤3次，免疫组化染色，苏木精复染，0.1% HCl分化，蓝化，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化结果评估由专业病理人员进行判定，每张组织切片随机选取8个视野，根据着色程度进行打分。其中着色程度：与背景一致为0分、浅黄色1分、棕黄色2分、深褐色3分；蛋白表达定量分析用Image J图像分析软件对免疫组化反应物的颜色区域与对照组进行平均光密度或者积分光密度分析。

1.6 MTT法检测细胞活力 为检测不同浓度氯喹对细胞活力的影响，将生长至对数期的HepG2肝癌细胞以5×104/mL的浓度接种于96孔板，每孔0.2 mL，对照组、氯喹处理组各3孔，并设置3组重复。待24 h细胞贴壁后，向氯喹低剂量和高剂量处理组中分别加入含25 μmol/L和50 μmol/L氯喹的DMEM培养基，对照组则加入等体积的PBS缓冲液，培养24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，置于培养箱分别培养24 h。然后弃去培养基，每孔加入150 μL DMSO，震荡混匀，用酶标仪检测各孔细胞在570 nm波长处的OD值，计算细胞存活率并绘制相应的浓度-存活曲线。

2 结果

2.1 造模基本情况比较 体内实验均显示造模第5天开始进入肿瘤初期，小鼠腋下可见瘤体形成，随后继续增大，约第10天可见肿瘤突起，小鼠精神萎靡，活动量显著下降，且觅食减少。小鼠表面特征无明显差异，实验周期内无小鼠死亡。小鼠的体质量、出瘤时间以及造模成功率差异均无统计学意义(P>0.05)。造模成功后分为对照组、低剂量氯喹组和高剂量氯喹组。详见表1。

表1 裸小鼠造模后基本情况比较

2.2 Western blot检测氯喹对肝癌组织自噬水平的影响 对照组小鼠肝癌组织中LC3-Ⅱ蛋白(1.26±0.21)%和 P62(3.62±0.32)%的相对表达水平较低，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值也较低。与对照组相比，氯喹处理组小鼠肝癌组织中LC3-Ⅱ(3.15±0.29)%[q=37.325,P<0.001]和P62(6.24±0.41)%[q=35.621,P<0.001]的蛋白水平均提高，3组间比较差异统计学分析有意义(F=696.587，P<0.001，F=537.265，P<0.001)；LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值也增加[(3.53±0.61) 比(1.62±0.43)，q=18.631，P<0.001)]，3组间比较差异有统计学意义(F=163.739，P<0.001)；且高剂量氯喹处理组小鼠肝癌组织中LC3-Ⅱ(10.05±0.83)%和P62(15.16±0.73)%蛋白的增加幅度高于氯喹低剂量处理组[LC3-Ⅱ(6.26±0.49)%(q=27.805，P<0.001)和P62(9.78±0.45)%(q=44.361，P<0.001)]。详见图1。

2.3 免疫组化检测氯喹对小鼠肝癌组织自噬水平的影响 对照组小鼠肝癌组织中LC3(5.62±0.43)%和P62(6.32±0.51)%的表达水平均处于较低水平，细胞阳性率低，染色强度较弱，而氯喹处理组小鼠肝癌组织中的LC3和P62表达水平均上升[LC3(10.33±0.75)%(q=82.181，P<0.001)和P62(11.08±0.59)%(q=91.920，P<0.001)]，并且随着氯喹处理浓度的增加，组织染色更深，细胞阳性率更高[LC3(17.60±0.92)%(q=49.871，P<0.001)和P62(19.71±0.23)%，t=13.08，P=0.029(q=50.700，P<0.001)]，3组间的比较差异有统计学意义(F=144.712，P<0.001；F=226.641，P<0.001)]。详见图2。

2.4 MTT比色法检测氯喹对HepG2肝癌细胞的增殖抑制率 与对照组相比，不同剂量的氯喹相同时间处理组细胞的增殖率均下降(162.26±18.62)%(q=12.937，P=0.021)和(162.38±18.75)%(q=15.397，P=0.016)；3组间比较差异有统计学意义(F=38.566，P<0.001)。随着氯喹作用时间的增加，低剂量氯喹处理组细胞增值率均下降(112.54±16.87)%(q=13.875，P=0.017)；高剂量氯喹处理组细胞的增殖率均下降(109.24±15.98)%(q=14.586，P=0.013)，不同时间点的比较差异有统计学意义(F=138.271，P<0.001；F=79.652，P<0.001)详见图3。

图3 MTT法检测氯喹对HepG2细胞的增殖抑制率

3 讨论

自噬是真核细胞内由内质网脱落的膜结构包裹胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自吞噬体，后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，并降解其内的内容物，以维持细胞自身的生长代谢和细胞成分的更新，参与细胞分化，生长调控，组织修复，抗原呈递以及外界应激等多种生理过程[6]。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，LC3-Ⅰ位于胞浆中，通过其羧基与脂质的共价连接转化为LC3-Ⅱ，并定位于自噬体膜上，这是自噬体形成的重要过程，当自噬体与溶酶体结合时，LC3-Ⅰ解离循环至胞质中，LC3-Ⅱ则依旧位于自噬溶酶体内膜上，其含量的多少与自噬膜囊泡的数量呈正比[7]。P62蛋白在细胞中可经自噬过程被选择性降解，是细胞自体吞噬特异性底物。自噬被抑制中，P62蛋白的上游表达增强或下游降解被阻断均可导致P62的大量积聚，因此P62蛋白的量可作为自噬行为的检测指标[8]。

自噬溶酶体的正常作用发挥需要其内有活性的水解酶的参与，氯喹则是一种溶酶体靶向药物，它通过抑制多种蛋白酶的活性从而抑制蛋白的水解和糖脂的代谢等多种代谢途径，导致自噬体内的物质无法通过溶酶体降解，自噬性囊泡过度累积，溶酶体膜通透性发生改变进而肿胀和破裂，最终导致细胞的死亡[9-10]。虽然氯喹是目前少数能够安全应用于体内的自噬抑制药物之一，但其是否在各种肿瘤治疗中发挥积极作用仍存在较大的争议。

本实验表明LC3-Ⅱ和P62表达水平的相对增加，可能是由于氯喹抑制了自噬溶酶体的形成和自噬小体在溶酶体的降解，导致自噬体的累积，则LC3-Ⅱ和P62蛋白含量也相应增加,这说明氯喹能显著抑制小鼠肝癌细胞的自噬活性。MTT实验也同样验证了氯喹对小鼠肝癌细胞的抑制效果。之前研究[11]已经证明氯喹处理的肝癌细胞其自噬水平明显降低，说明氯喹可能是通过抑制肿瘤细胞的自噬从而抑制了肿瘤细胞的增殖。这一结果与氯喹在其他肿瘤组织中的作用研究[12]一致，已有研究[13]证明氯喹联合其他化疗药物使用能显著增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

尽管氯喹在促进肿瘤细胞的自噬，抑制肿瘤细胞的增殖等方面的作用已受到广泛的关注和研究，但其在不同动物体内的作用剂量和机制存在较大差异，与各种化疗药物的联合用药也会引起不同效果，因此氯喹作为抗肿瘤辅助药物的应用仍需进一步的探索与研究。