基层动物疫病快速检测诊断技术平台的建立及应用

康冬柳 ，邢江峰 ，胡爱明 ，张付华 ，徐俊杰 ，文明华

（1.吉安市畜牧兽医局，江西 吉安 343000；2.北京一立科技公司；3.九江市畜牧兽医局；4.南昌市动物疫病预防控制中心；5.宜春市畜牧水产局；）

目前市级以下动物疫病预防控制机构由于设备、人员的缺乏，技术水平较低，造成多数动物疫病在基层不能及时检测和诊断，有些疫病或样本在基层无法开展病原学检测，从而造成动物疫病的处置延迟和病原扩散，给养殖业造成损失甚至发生人畜共患病。因此，如何快速诊断动物疫病、“早快严小”控制动物疫情成为我们亟需解决的关键问题。

借鉴国内外先进技术，我们探索建立了一套针对基层动物疫病检测诊断的技术手段和解决方案，开发研究适合基层动物疫病检验诊断的技术平台。技术平台可根据具体地区研发不同疫病、项目的检测试剂盒，简化操作步骤和设备，灵敏度和操作性比现有试剂更优。从而实现只需有PCR仪及常见设备、耗材，就能在市级以下动物疫病预防控制机构甚至养殖场、流动诊断车上都能开展病原学检测的动物疫病诊断新局面。同时由于优化了检测方法，减少了操作步骤，具有实验操作水平的工作人员可直接使用，或者没有操作水平的工作人员可在极短期的培训后可直接上岗，解决了实验室专业人员不足的困难。

1 技术平台简介

随着分子生物学相关领域的发展，实时荧光定量PCR(qPCR)技术也得到了越来越广泛的应用。在遗传病检测、个体化用药检测、病原体检测等领域qPCR技术已经成为不可或缺的基本技术。现在传统的检测方法是使用柱提法或磁珠法先从检测样本中将核酸提取出来，然后将提取好的核酸加入到配置好的PCR反应液里，这种传统的荧光PCR方法需要人工干预的步骤较多，而且对实验室的要求也高，整个反应流程需要4～6h。

我们建立的直扩qPCR技术平台（POCT qPCR），使用1st TECH核酸定向释放剂10min即可完成样本中DNA和RNA的释放，同时可将样本中干扰qPCR反应效率的物质凝固；释放后的核酸样本可以直接加入PCR反应液中进行反应，将qPCR检测缩短至60min左右。

同时我们还建立了一种即用型qPCR的反应体系，省去了配置PCR反应液的实验过程，与1st TECH核酸定向释放剂配合使用可以使qPCR反应操作更简单。

2 技术平台优势

核酸提取方法和传统的核酸提取方法的比较：

3 应用

3.1 我们将该技术平台初步应用于动物H7N9的病原学监测和筛查，完成监测任务5 000余份次，具有设备简化、步骤简单、操作方便、灵敏度高等特点，非常适合市级以下基层动物疫病预防控制机构应用。

3.2 该技术平台可用于多种类型样本的检测

①血液样本：全血样本、血清、血浆、指尖血；

②分泌物样本：口腔拭子、咽拭子、肛拭子、生殖道分泌物或拭子、动物咽拭子；

③组织或细胞样本：组织研磨上清液、细胞培养液、细菌或病毒培养物。

3.3 可根据具体地区、具体病种继续研发不同疫病、项目的检测试剂盒。

3.4 可用于样本中RNA和DNA的检测，国内同类产品只能进行DNA的检测。我们可以将传统qPCR的检测时间缩短至少1h以上，尤其适合于动物疫病的快速筛查，在最短的时间内就可以将结果上报，为正确的处理疫情赢得了时间。