一株产柚苷酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

袁文博， 江 波， 张 涛

（食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

柚苷酶是由 α-L-鼠李糖苷酶 （α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）和 β-D-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21）组成的酶复合体[1]。 它可作用于柚皮苷、槲皮苷、柴胡皂苷、芦丁、橘皮苷等架构末端有α-鼠李糖和β-葡萄糖的人工或天然的糖苷类化合物[2]。柚苷酶可以将芸香科水果果汁中最主要的苦味物质柚皮苷分两步水解成鼠李糖、柚皮素和葡萄糖，以达到脱苦的目的[3]，这两种酶在参与反应过程中是先后起作用的，具体反应如下：

与其他脱苦方法相比，酶法脱苦具有效果好、无污染、成本低、工艺简单、专一性强、反应条件温和、不破坏果汁中的风味和营养成份等优点[3]，具有良好的应用前景。除此之外，柚苷酶在活性物质改性[4]、增强物质生物学活性[5]、葡萄酒的增香[3]、物质的分离制备[6]、制药工业[7]等方面的应用也日益广泛。

柚苷酶的来源非常广泛，植物、动物和微生物中均有发现，现在柚苷酶的来源以微生物为主。例如胡奎[8]从土壤中分离出了一株摇瓶产酶达291 U/mL，经NTG诱变后可达1 282 U/mL。文蓉[9]在发霉的柚子皮上筛选到一株产柚苷酶的青霉菌，经诱变后酶活达573.6 U/mL。据报道，国外已有少量的柚苷酶实现工业化生产，但价格昂贵，难以适应食品工业的需求。而在国内并没有实现柚苷酶的工业化生产，主要是缺乏适合工业化生产的高产菌株[10]；其次是缺少成熟的柚苷酶液态发酵生产工艺。因此，发现新的柚苷酶微生物来源，并研究其发酵柚苷酶的条件具有重要的科学研究及应用价值。

从自然界筛选出来的野生菌株通常具有遗传不稳定、性能和耐受性差等缺点，常常不能满足工业化生产的要求，因此采用不同的方法对分离出来的野生菌株进行诱变选育是不可或缺的[11]。新型常压室温等离子体（ARTP）诱变系统，通过发射含有活性粒子的等离子体，能够有效引起DNA的多样性损伤，最终导致微生物突变。ARTP生物诱变育种技术与传统微生物诱变方法相比，具有安全性高、操作简易、成本低、快速有效等优势[12-14]，已经成为微生物诱变育种领域的一个新的研究热点。目前，尚未有使用常压室温等离子体诱变筛选柚苷酶高产菌株方法的报道。

作者以实验室筛选出的一株之前并未报道过的产柚苷酶菌株A.alternate SK37.001为出发菌株，通过常温室压等离子体诱变，发酵酶活大幅度提高。之后研究了碳源、氮源等因素对菌株产柚苷酶的影响，通过单因素、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计对菌株产柚苷酶的液态摇瓶发酵培养基进行了优化，目的在于获得菌株发酵产柚苷酶的最佳培养基，为进一步工业化生产柚苷酶提供了技术和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株互隔交链孢霉（A.alternate）：保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2015309。

1.1.2 培养基斜面保藏培养基采用马铃薯培养基（g/L）：马铃薯 200，蔗糖 20，琼脂 20；pH 自然，121℃灭菌20 min。

种子培养基与初始发酵培养基（g/L）：蔗糖5、柚皮苷 5，NaNO32，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO40.5，FeSO40.1；pH 自然，121 ℃灭菌 20 min。

1.2 主要仪器

高效液相色谱仪：Agilent 1200；色谱柱：Sepax GP-C18 4.6 mm×250 mm；超声波细胞破碎仪：宁波新芝生物科技有限公司SCIENTZ-ⅡD；ARTP微生物诱变育种机：北京思清源生物技术公司。

1.3 实验方法

1.3.1 柚苷酶粗酶液的制备将菌株在种子培养基中培养12 h，以5%的接种体积分数接种在含40mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，在30℃、200 r/min条件下摇瓶发酵96 h，取发酵液在常温下10 000 r/min离心20 min后收集菌体沉淀，用pH 4.0的磷酸氢二钠（0.1 mol/L）-柠檬酸（0.05 mol/L）缓冲液洗涤菌体3次，用与发酵液等体积的缓冲液溶解，用6 cm的超声波探头超声破碎10 min，功率为20%，得到悬浮液在10 000 r/min下离心10 min，取上清液即为胞内粗酶液。

1.3.2 酶活测定方法

1）样品的前处理：取2 mL用缓冲液制备的0.1%柚皮苷标准溶液于小离心管中，在40℃的恒温振荡水浴中预热5 min。接着用移液枪加入0.1 mL的粗酶液，充分振荡混匀，精确计时保温10 min后从恒温水浴中取出放入沸水浴中10 min，使酶失活，加入1.9 mL的甲醇溶液，经10 000 r/min离心10 min后取上清液。空白为加入灭活的粗酶液，其他操作相同。

2）柚皮苷和柚皮素的定性定量测定：将处理后的反应液用0.22 μm的滤膜过滤，用HPLC（采用Sepax C18色谱柱）检测柚皮苷和柚皮素的峰面积。色谱条件：流动相组成为 V甲醇∶V水=1∶1，流速 1 mL/min，柱温 35℃，检测波长 280 nm，进样量 10 μL。

3）柚苷酶酶活力的定义：在温度40℃、pH 4.0条件下，每分钟消耗1 μg柚皮苷为1 U。

1.3.3 互隔交链孢霉的常压室温等离子体诱变方法

1）单孢子悬浮液的制备：取活化好的A.alternate SK37.001斜面，用无菌生理盐水冲洗，将其装入含有无菌玻璃珠的摇瓶内振荡15 min，采用无菌双层擦镜纸过滤，即得单孢子悬液。然后用血球计数板对悬液中的孢子进行镜检计数，并将孢子浓度调整到 106～107个/mL。

2）ARTP诱变操作：将10 μL的孢子悬液均匀涂步于金属载片的表面上。采用氦气为工作气体，设置处理功率为120 W，处理距离为2 mm，气流量为10 SLM，在此条件下对A.alternate SK37.001进行诱变处理。为了寻找最佳的诱变处理时间，作者将孢子分别处理 0、20、30、40、50、60、80、100、120 s，对处理过的样品在适当的稀释度下涂板，通过CFU来计算致死率，并绘出致死曲线[15]。

致死率（%）=（（U－T）/U）×100%

式中，U为不经诱变处理生长的菌落数；T为经诱变处理后生长的菌落数。

1.3.4 生物量的测定将摇瓶发酵液于10 000 r/min离心10 min，将沉淀用蒸馏水洗涤3次，置于105℃下烘干至恒重，冷却后称重。

1.3.5 发酵培养基优化的试验设计按照1.3.1的方法，通过酶活的比较，分别考察碳源的种类和最佳配比、氮源的种类对A.alternate发酵产柚苷酶的影响。在单因素实验结果的基础上采用Plackett-Burman试验筛选重要因子，然后对重要因子进行最陡爬坡实验确定重要因子的最佳添加量，最后根据Box-Behnken实验原理，用design expert 8.0.6软件在最陡爬坡试验的基础上进行实验设计，通过实验数据拟合得到响应面模型，最终确定最优实验条件，并进行验证。

2 结果与讨论

2.1 常温室压等离子体诱变对互隔交链孢产柚苷酶的影响

按方法1.3.3对A.alternata SK37.001诱变致死率进行计算，得到致死率曲线，见图1。

图1 ARTP诱变对互隔交链孢霉SK37.001的致死率曲线Fig.1 Lethality rate of Alternaria alternata 37.001 by ARTP

从图1可以看出，等离子体对互隔交链孢霉SK37.001的致死率存在着显著的剂量效应关系，诱变时间越长，菌株的致死率越高。ARTP对互隔交链孢霉具有很强的致死率，当诱变时间为80 s时，致死率就超过90%，而诱变时间达到150 s时，几乎没有存活。由于诱变产生的正突变具有随机性，为了保证筛选到正突变菌株，同时也能够快速分离生存能力高的菌株，故选取处理时间为80、100、120 s，三个不同致死率下的孢子悬液进行混合涂布。

通过涂布后生长菌株透明圈的大小进行初筛，然后复筛得到了一株产酶能力达327.32 U/mL的菌株，相比于野生菌株产酶能力提高了近208%，菌体干重增长了123.7%，把此诱变后的菌株命名为Alternaria alternata SK37.002，通过遗传性状稳定性试验，Alternaria alternata SK37.002在斜面培养基上连续培养8代，菌株生长稳定，其柚苷酶产量稳定在316.14～331.23 U/mL之间，表明该菌株遗传性能稳定。

2.2 不同碳源对互隔交链孢产柚苷酶的影响

在预实验中发现当蔗糖或葡萄糖质量浓度大于5 g/L时，会抑制柚苷酶的产生。所以分别选取柚皮苷和鼠李糖为诱导物，选取最适诱导物的添加量，同时寻找最适的碳源，以下面4种情况探究最佳配比的碳源。

1）以柚皮苷为惟一碳源：分别配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷培养基；

2）以鼠李糖为惟一碳源：分别配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的鼠李糖培养基；

3）以5 g/L葡萄糖为基础碳源：分别配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作为诱导物的培养基；

4）以5 g/L的蔗糖为基础碳源：分别配制含0.5、1、1.5、2、2.5 g/L 的柚皮苷作为诱导物的培养基。

在相同培养条件下进行摇瓶发酵培养，每种碳源做3次平行实验，4 d后用HPLC法测酶活，取平均值，以柚皮苷或鼠李糖添加量为横坐标，柚苷酶酶活为纵坐标，得到不同碳源对Alternaria alternata SK37.002产柚苷酶的影响见图2。

图2 不同碳源对互隔交链孢酶SK37.002产柚苷酶的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on naringinase productivity of Alternaria alternata SK37.002

微生物与糖利用有关的许多酶都是诱导性的，柚苷酶也是诱导酶。由图2可以看出，摇瓶发酵培养基中是否添加诱导物显著影响其产酶，说明A.alternata SK37.002产柚苷酶需要诱导物诱导，这与胡奎[8]的研究结果相同。底物柚皮苷和产物鼠李糖均有诱导作用，其中柚皮苷诱导作用更好，而且添加量为1.5 g/L时菌株产酶能力即达到顶点，再继续添加柚皮苷酶活增加不明显。在以柚皮苷为诱导物时，用蔗糖作为碳源比葡萄糖更适宜，究其原因可能是因为葡萄糖作为碳源时，会形成葡萄糖效应[16]。同时含有一定量的蔗糖可以加快孢子萌发、加速菌丝生长[17]，非常有助于胞内酶酶活的提高。最终选取5 g/L的蔗糖作为碳源，1 g/L的柚皮苷作为诱导物。

2.3 不同氮源对互隔交链孢SK37.002产柚苷酶的影响

在最适碳源和诱导物的基础上，分别配制添加量为 4 g/L 的蛋白胨、酵母提取物、（NH4）2SO4、牛肉膏、NaNO3、玉米浆这6种不同氮源的培养液，以1.3.1的方法进行培养，每种氮源做3次平行实验，用HPLC法测酶活，并取平均值，结果见图3。

图3 不同氮源对A.alternata SK37.002产柚苷酶的影响Fig.3 Effects of different nitrogen sources on naringinase productivity of A.alternata SK37.002

从图3可以看出，氮源对互隔交链孢霉产柚苷酶的影响较大，当以硫酸铵、酵母提取物、蛋白胨作为氮源时，酶活偏低；而硝酸钠作为氮源时，柚苷酶酶活最高，为467.96 U/mL，其次是牛肉膏、玉米浆。这可能是由于A.alternata能够更好地利用NO-中的氮离子，所以最后选择硝酸钠为A.alternata SK37.002菌株产柚苷酶的最佳氮源。

2.4 Plackett-Burman试验设计

在优化发酵培养基成分的基础上，选取柚皮苷质量浓度、硝酸钠质量浓度、温度、时间、氯化钙质量浓度、接种体积分数、硫酸镁、磷酸氢二钾质量浓度这8个可能影响互隔交链孢霉SK37.002发酵产柚苷酶的因素进行全面考察，选用n=12的Plackett-Burman设计。每个因素取高（+1）低（-1）两个水平，其中低水平为未优化的原始培养基，高水平为低水平的1.25倍左右。PB试验方案及试验测定柚苷酶酶活的结果见表 1。 A、B、D、E、G、H、J、K 分别代表柚皮苷质量浓度、硝酸钠质量浓度、温度、时间、氯化钙质量浓度、接种体积分数、硫酸镁质量浓度和磷酸氢二钾质量浓度，C、F、I为虚拟项，用于估计误差，排除干扰。

用Design-Expert 8.0.6软件对表1的数据进行柚苷酶活影响因子的显著性分析，结果见表2。

表1 PB试验设计方案及结果Table 1 Design and results of the Plackett-Burman experiment

表2 柚苷酶活影响因子的显著性分析Table 2 Significant factor analysis of naringinase activity

由表2可以看出，对A.alternata SK37.002产柚苷酶影响较大因素主要有硝酸钠（p=0.003 7）、氯化钙（p=0.049）、磷酸氢二钾（p=0.031），这 3 个因素对产酶影响较为显著，其中硝酸钠的p值小于0.01，可信度高于99%，氯化钙和磷酸氢二钾p值小于0.05，大于0.01，可信度高于95%。其中硝酸钠的回归系数为正数，为正效应，在设计响应面试验时要适当增加其添加量，氯化钙和磷酸氢二钾为负效应，设计试验时应适当减少其添加量。因此，选择这三个因素做响应面实验。

2.5 最陡爬坡实验

由于响应面拟合方程只有在考察的附近区域里才充分接近实际的情形，因此应使得显著因素的水平尽量接近最大产酶区域再创建有效的拟合方程，最陡爬坡实验能够满足此要求。根据PB试验得到的结论，设定爬坡方向和步长，硝酸钠每次提高0.5个单位，氯化钙和磷酸氢二钾每次降低0.1个单位，结果见表3。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiment

由表3可知，0+△2水平时柚苷酶酶活达到最大值，可以确定最佳发酵培养基在0+△2水平附近，故选此水平为中心点进行接下来的响应面设计。

2.6 Box-Behnken Design试验设计及结果

Box-Behnken Design（BBD）法是响应面分析法中常用的设计方法之一，可以用较少的实验次数对实验进行全面研究，通过对几个响应过程变量进行数学建模和分析来定向优化分析的因素[18]。作者依据Plackett-Burman试验确定的因素与最陡爬坡实验确定的范围，采用BBD实验设计A.alternate SK37.002发酵产柚苷酶培养基进行三因素三水平的响应面分析，各个因素与水平见表4，BBD实验设计及结果见表5。

采用Design-Expert 8.0.6软件对表5中的数据进行二次回归分析，得到回归方程为：Y=612.98+21.68X1-9.23X2+2.24X3-6.06X1X2+1.31X1X3-3.04X2X3-21.02X12-24.14X22-27.71X32，对二阶回归方程进行方差分析，结果见表6。

表4 BBD试验影响因子和水平设计Table 4 Factors and levels of the BBD experiment

表5 BBD试验设计及结果Table 5 Design and results of the BBD experiment

表6 二次回归方程的方差分析Table 6 Analysis of variance for the second order equation

从表6可以看出，模型回归极显著，其中方程的相关系数R2=98.67%，说明回归方程的拟合程度很好。调整相关系数Adj R2=97.05%，说明响应面97.05%的变化可以由此模型解释，模型与实际情况拟合得很好。硝酸钠和氯化钙对A.alternate SK.37.002菌株产柚苷酶的影响非常显著，并且二者之间有较为显著的交互作用。同硝酸钠和氯化钙之间的交互作用相比，硝酸钠与磷酸氢二钾、氯化钙与磷酸氢二钾之间的交互作用并不显著。这表明了各因素对柚苷酶酶活的影响并不是单纯的线性关系，二次项对柚苷酶活也有重要的影响。表格中失拟项P=0.63，大于0.05，表明试验数据正常，模型合适。

为了确定最佳液态发酵条件，用Design-Expert 8.0.6软件对回归模型进行响应面分析。绘制三维立体响应面图，其中每个响应面分析图分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第三个变量保持在最佳水平，见图4。

图4 各因素交互作用的响应面图Fig.4 Response surface plots for the pairwise interactive effects of NaNO3，CaCl2 and K2HPO4 on naringinase activity in final fermentation broth

从图4可以看出，硝酸钠、氯化钙、磷酸氢二钾添加量与酶活存在显著的相关性，回归方程存在最大值，为了求得 X1、X2、X3的最佳取值，对所得的回归拟合方程的变量求一阶偏导数，并令其为0，得到三元一次方程组，求解得出该模型的极值点：X1=3.40、X2=-19.72、X3=1.20，即硝酸钠、氯化钙、磷酸氢二钾的最佳质量浓度分别为5.11、0.69、0.83 g/L时，响应值Y达到最大值，即酶活最高为620.31 U/mL，菌体干重比未优化前增长了142.3%，表7为近5年柚苷酶发酵酶活的对比。

表7 近5年柚苷酶发酵酶活对比Table 7 Comparison of Naringinase activity in five years

为了检验模型的准确性，在预测最佳液态发酵培养基下进行发酵实验3次，为了方便操作，实验选择硝酸钠、氯化钙、磷酸氢二钾的质量浓度分别为 5，0.7，0.8 g/L，所得的实际酶活为（624.73±30.33）U/mL，与理论预测值620.31 U/mL接近，与初始酶活相比提高了90%。由此可见，响应面优化得到的最佳培养基成分准确可靠，具有实际意义。

3 结语

作者以实验室筛选得到的Alternaria alternate为出发菌株。通过常温室压等离子体（ARTP）诱变获得了一株发酵酶活达327.32 U/mL的菌株，产酶能力比野生菌株提高了208%。可以看出ARTP诱变育种技术是一种新型、有效的微生物诱变育种方法，为柚苷酶的工业化生产提供了获得优良菌种的方法。通过单因素实验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡实验和Box-Benhnken试验对该菌产柚苷酶的液态摇瓶发酵培养基成分进行优化，得到Alternaria alternate产柚苷酶的最佳条件：蔗糖5 g/L、柚皮苷1 g/L、硝酸钠5 g/L，磷酸氢二钾0.8 g/L，氯化钙0.7 g/L，氯化钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L。在此条件下，发酵酶活可达624.73±30.33 U/mL，比未优化之 前增加了90.86%。