蓝靛果酒化学降酸工艺及对花色苷组成的影响

梁敏，包怡红，徐福成

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）（2.黑河市中俄林业科技合作园，黑龙江黑河 164300）

蓝靛果为忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属（Lonicera L）的多年生落叶小灌木[1]，其果实内含有多种营养物质，如有机酸、糖、维生素、矿物质、黄酮、多酚和花色苷等，特别是花色苷。研究表明，蓝靛果中的花色苷具有美容养颜、抗氧化[2]、降脂[3]、抗肿瘤[4]和抑菌[5]等功效。因其口味酸涩，很少用来直接食用，此外由于蓝靛果不易保藏，常常加工成果汁、果酒、果酱、糖果、膨化零食、果干、罐头和冷冻水果等产品[6～8]。可滴定酸度是影响葡萄酒、果酒风味的重要因素，对果酒的感官品质起着非常重要的作用。若酸度过高，会使果酒变得刺口、粗糙，而酸度过低，又会使果酒变得平淡、欠清爽[9]，通常果酒的可滴定酸度介于7～9 g/L。蓝靛果作为营养丰富的小浆果，其含酸量较高（通常在16.8～27.1 g/kg[10]）。此外，在酵母发酵成果酒的过程中会因为琥珀酸、乳酸、葡萄糖酸和乙酸等的形成而使得可滴定酸度升高，且酸度增加通常在1～2.5 g/L。目前，国内外关于果汁和果酒的降酸方法有很多种，主要包括生物降酸法[11]、物理降酸法[12]、离子交换树脂法、电渗析降酸法[13,14]和化学降酸法[15]，但使用比较广泛的还是化学降酸法，其具有降酸速度快、成本低、效果显著等诸多优点，但是要注意降酸剂的选择和使用量以免造成酒体失衡[16]。

蓝靛果酿造所得果酒的可滴定酸度较高，采用生物降酸或物理降酸很难达到一般的果酒滴定酸度范围（7～9 g/L）。因此，本试验选择化学降酸法进行降酸，并选择复合降酸剂进行果酒降酸处理，确定最优降酸工艺并分析降酸处理对花色苷含量及组成的影响，为高品质蓝靛果酒的生产提供理论依据和参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与实验试剂

蓝靛果由黑河市中俄林业科技合作园提供；甲酸（色谱级）、甲醇（色谱级），天津市福晨化学试剂厂；无水碳酸钠、无水碳酸钾，天津市博迪化工股份有限公司；碳酸氢钠，沈阳含怡食品有限公司；碳酸钙，天津市科密欧化学试剂开发中心；酒石酸钾，天津市巴斯夫化工有限公司；氯化钾、乙酸钠，天津市天力化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

FA2004B电子天平、721可见光分光光度计、FA-2004B电子分析天平，上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-3E雷磁pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；H/T20MM 台式高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；Agilent 1290液相色谱和6430串联四级杆液质联用仪，美国Aglient。

1.2 试验方法

1.2.1 蓝靛果酒化学降酸

取蓝靛果酒100 mL，分别加入6种不同的化学降酸剂（碳酸钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、酒石酸钾）进行降酸试验，充分搅拌后，于室温下放置1 d[9]后，每个处理重复3次，测定不同化学降酸剂对蓝靛果果酒总酸、pH、花色苷含量及果酒感官品质的影响。

1.2.2 蓝靛果酒碳酸钙和碳酸钠联合降酸

表1 碳酸钙和碳酸钠降酸组合表Table 1 Table of combination of Calcium carbonate and sodium carbonate

根据上述降酸剂的试验，选择降酸效果好，对果酒pH影响较小，且尽可能保留发酵液中花色苷的降酸剂：碳酸钙和碳酸钠进行联合降酸。

1.2.3 降酸对蓝靛果酒花色苷组成的影响

将蓝靛果酒经复合降酸剂降酸后，采用高效液相色谱-串联质谱对蓝靛果酒的花色苷组成进行分析。

1.2.4 总酸和pH值的测定

总酸：参照GB/T 12456-2008 食品中总酸的测定中的酸碱滴定法；pH值：pH计测定。

1.2.5 花色苷含量测定

采用pH示差法[17]。将蓝靛果酒样品于4000 r/min离心15 min，取上清液进行稀释。取1 mL稀释液，分别添加9 mL pH 1.0的KCl-HCl溶液和pH 4.5的CH3COONa-HCl溶液，室温避光放置20 min。采用可见光分光光度计于波长510 nm和700 nm处测定吸光度，以蒸馏水调零。花色苷含量表示为每升蓝靛果上清液中矢车菊素-3-葡萄糖苷当量（mg/L），计算公式如下：

花色苷含量(mg/L)=(∆A×MW×DF×1000)/(ε×1)

式中：ΔA=（A510-A700）pH 1.0-（A510-A700）pH 4.5；MW=449.2 g/mol，是矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量；DF为稀释倍数；l为比色皿的光程长度，通常为1；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900 L/(mol·cm)。

1.2.6 钙离子含量测定

吸取样品0.5 mL和49.5 mL蒸馏水于250 mL三角瓶内，加1+1盐酸3滴，混匀，加热煮沸半分钟，冷却至50 ℃以下，加入5 mL KOH，再加80 mg钙黄绿素酚酞指示剂（0.2 g钙黄绿素+0.07 g酚酞+20 g KCl，研磨混匀）放置20 min，在暗处背对光线，用0.01 mol/L EDTA滴定荧光黄绿色消失，出现红色即为终点，一个样品处理三次。

样品中Ca2+含量X（mg/L）：

其中，V-滴定EDTA的消耗体积，mL；V0-滴定空白样消耗的体积，mL；C-EDTA 标准溶液，mol/L；Vw-样品体积，mL；40.08-Ca2+摩尔质量，g/mol。

1.2.7 花色苷组成的测定

采用高效液相色谱-串联质谱联用技术测定：

（1）样品准备：将样品在6000 r/min下离心15 min，取上清液经0.45 μm的滤膜过滤，于-4 ℃下保存备用。

（2）高效液相色谱条件：色谱柱：UHPAQ C18（2.1×50 mm，1.9 μm）。柱温 27 ℃，进样体积 5 μL。流动相：0.1%甲酸溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱条件：0 min，85%A；1～2 min，50%A，4～6 min，20%A；7 min，85%A。流速：0.30 mL/min。

（3）质谱条件：采用正离子采集模式。扫描范围为400～1000 m/z；毛细管温度：300 ℃；毛细管电压：4 kV；干燥气压力：15 psi；流速：11 L/min。

1.3 数据统计分析

所有试验均进行三次重复，采用Origin 8进行数据处理分析及画图，结果表示为平均值±标准差，采用SPSS 22进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 碳酸钾降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

由表2可知，随着碳酸钾添加量的增大，蓝靛果酒的总酸不断降低，降酸量不断增加。添加1 g/L碳酸钾可以降低蓝靛果酒约1.10 g/L酸度。随着碳酸钾的增加，蓝靛果酒pH逐渐增大，花色苷含量不断降低。但是，当碳酸钾添加量＞1 g/L时，蓝靛果酒的品质会逐渐变差，产生明显的苦涩味，破坏了蓝靛果酒原有的香味和口感，所以碳酸钾不适合作为蓝靛果酒的降酸剂。

2.2 碳酸钙降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

由表3可知，随着碳酸钙添加量的增加，蓝靛果酒的总酸逐渐降低，降酸效果比碳酸钾更明显，当碳酸钙添加量为1.0 g/L时，总酸降低了1.69 g/L，降幅达10.97%，随后，随着碳酸钙的继续加入，总酸仍处于逐渐下降的趋势。通过感官评价发现，当碳酸钙的添加量＜3 g/L时，碳酸钙的加入对果酒品质影响较小，当继续增加碳酸钙用量时，不仅会增加蓝靛果酒的涩味，还会带入浓厚的石灰味，减弱蓝靛果酒的果香和酒香。蓝靛果酒中的花色苷含量随着碳酸钙的添加量而逐渐降低，这主要是因为碳酸钙的加入使得蓝靛果酒的pH逐渐升高，而花色苷在较高pH时结构不稳定，易降解。综合考虑，碳酸钙降酸操作简单，成本较低，但是，单独使用碳酸钙达不到蓝靛果酒满意的酸度，需与其他降酸剂联合使用，且碳酸钙添加量不能超过3 g/L。

表2 碳酸钾的降酸结果Table 2 The deacidification results of Potassium carbonate

表3 碳酸钙的降酸结果Table 3 The deacidification results of Calcium carbonate

2.3 碳酸钠降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

经不同添加量的碳酸钠处理的蓝靛果酒的总酸、降酸量、降幅、pH、花色苷含量及蓝靛果酒香气和口感的变化如表 4。由表可以看出，碳酸钠的降酸效果较好，1 g/L碳酸钠可以降低1.68 g/L总酸，蓝靛果酒香气浓郁、无其他不良气味，随着碳酸钠的添加，总酸不断下降，当碳酸钠添加量达到5.0 g/L时，总酸下降7.00 g/L，降幅达45.45%，此时蓝靛果酒酸度达到果酒的理想范围，香气较淡，酸度适中。随着碳酸钠添加量的增加，花色苷含量在逐渐降低，但是与碳酸钙、碳酸钾相比，添加量为6 g/L时，碳酸钠降酸所保留的花色苷更多。因此，综合考虑，碳酸钠适用于蓝靛果酒的降酸。

表4 碳酸钠的降酸结果Table 4 The deacidification results of sodium carbonate

2.4 酒石酸钾降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

采用酒石酸钾对蓝靛果酒进行降酸，结果见表5。随着酒石酸钾添加量的增大，蓝靛果酒的总酸不断降低，但是降酸效果不佳，当添加6 g/L的酒石酸钾，总酸降低量仅为0.58 g/L。酒石酸钾的加入对蓝靛果酒的花色苷含量影响较小，能够保留更多的花色苷。但是，若想将蓝靛果酒降到合适的酸度，需要继续添加酒石酸钾，成本较高，且添加量过多会给蓝靛果酒增加涩味，综合评价酒石酸钾不适用于蓝靛果酒的降酸。

表5 酒石酸钾的降酸结果Table 5 The deacidification results of potassium tartrate

2.5 碳酸氢钠降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

采用碳酸氢钠对蓝靛果酒降酸，降酸结果见表6。由表6可以看出，碳酸氢钠添加量为6 g/L时，蓝靛果酒酸度降低了5.07 g/L，蓝靛果酒酸涩感降低、香气较浓。与碳酸钠和碳酸钙相比，降酸能力较低，若想将酸度降到理想水平，需要增大其用量，但是，继续增大碳酸氢钠用量会使蓝靛果酒花色苷含量继续降低，因此，碳酸氢钠不能单独作为蓝靛果酒的降酸剂，需与其他进行复配使用。

表6 碳酸氢钠的降酸结果Table 6 The deacidification results of sodium bicarbonate

2.6 碳酸氢钾降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

不同添加量的碳酸氢钾对蓝靛果酒降酸效果、pH、花色苷及感官品质的影响见表7。由表7可知，与碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙等化学降酸剂相比，碳酸氢钾对高酸度的蓝靛果酒的降酸效果较差。当碳酸氢钾添加量＜3 g/L时，随着碳酸氢钾添加量的增大，蓝靛果酒总酸呈现下降趋势，对蓝靛果酒的品质影响较小，但当碳酸氢钾的添加量＞3 g/L，会影响蓝靛果酒的香味和口感。此外，碳酸氢钾的加入使得果酒pH升高，花色苷含量下降。因此，碳酸氢钾不可单独作为蓝靛果酒的降酸剂，需与其他降酸剂复合进行降酸。

2.7 碳酸钠与碳酸钙联合降酸效果对蓝靛果酒品质的影响

采用6种化学降酸剂进行降酸发现六种降酸剂的降酸效果依次为：碳酸钠＞碳酸钙＞碳酸钾＞碳酸氢钠＞碳酸氢钾＞酒石酸钾，每6 g/L的降酸剂分别可以降低8.29、7.04、6.26、5.07、4.01、0.58 g/L的总酸。且碳酸钠和碳酸钙对果酒pH的影响较小，此外，碳酸钙的加入可以增加蓝靛果酒有机钙离子的含量。结合感官评价和花色苷含量最终选择碳酸钙和碳酸钠为复合降酸剂对蓝靛果酒进行降酸，降酸结果见表8。

表7 碳酸氢钾的降酸结果Table 7 The deacidification results of potassium bicarbonate

表8 碳酸钙与碳酸钠联合降酸结果Table 8 Results of Calcium carbonate combined with sodium carbonate

由表8可见，三种组合均可将蓝靛果酒酸度降至7～9 g/L，经过对比其pH、花色苷含量及感官评价发现，虽然组合1降酸效果更佳，但是较低的酸度会造成果酒香气的损失，因此与组合2和3相比，其口感略差。

对比组合2和3发现，碳酸钙的加入改善了果酒的品质，且使得果酒内钙离子含量增加，但是过多的碳酸钙会给蓝靛果酒引入较为明显的石灰味，因此，综合考虑，选择组合2为最佳降酸组合。

2.8 降酸对蓝靛果酒花色苷组成的影响结果

图1 TIC总色谱图Fig.1 TIC total chromatogram of blue honeysuckle wine

经化学降酸前后蓝靛果酒的花色苷组成的总离子流色谱图和一级质谱图见图1～图3。降酸对各个花色苷峰面积的影响见表9。

由图2、图3和表9可以看出，蓝靛果酒内的花色苷在经降酸后可以检测到8种花色苷，但各自的峰面积发生了一些变化，且总峰面积减少了19.92%。其中，矢车菊素-3-己糖苷衍生物，芍药素-3-芸香苷，矢车菊素-3-葡萄糖苷，芍药素-3-葡萄糖苷，天竺葵素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-乙酰基乙糖苷的峰面积均发生不同程度的降低，其降低范围在41.05%～67.63%之间，而矢车菊素-3,5-二己糖苷和芍药素-3,5-二己糖苷的峰面积有所上升，特别是芍药素-3,5-二己糖苷的峰面积是降酸前峰面积的10.42倍。

这可能是因为不同花色苷受pH的影响程度不同，在降酸过程中随pH的升高，蓝靛果酒内矢车菊素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-葡萄糖苷这两种单糖苷花色苷逐渐转变为其对应的二糖苷花色苷。

图2 降酸前花色苷一级质谱图Fig.2 Mass spectrometry of blue honeysuckle wine before deacidification

图3 蓝靛果酒降酸后一级质谱图Fig.3 Mass spectrometry of blue honeysuckle wine after deacidification

表9 降酸对花色苷组成的影响Table 9 Effect of deacidification on anthocyanins composition

6 1.559 463 301 芍药素-3-葡萄糖苷[19] 2015057 653307 7 1.413 449 287 矢车菊素-3-葡萄糖苷[19] 10333353 4476000.5 8 1.528 433 271 天竺葵素-3-葡萄糖苷[19,20] 79549 31135.5总峰面积 15332325 12277464.5

3 结论

3.1 本试验采用碳酸钾、碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、酒石酸钾钠对蓝靛果酒进行降酸，降酸效果依次为：碳酸钠＞碳酸钙＞碳酸钾＞碳酸氢钠＞碳酸氢钾＞酒石酸钾。其中碳酸钠的降酸效果最佳，其次为碳酸钙，由于碳酸钙的加入可以增加蓝靛果酒内钙离子的含量，选择了碳酸钙与碳酸钠为复合降酸剂对蓝靛果酒进行降酸，经过对比得到的最佳降酸组合为 2 g/L碳酸钙和3 g/L碳酸钠，在此条件下，蓝靛果酒的可滴定酸度可以降至7～9 g/L，且具有高浓度的有机钙离子和较好的感官品质。

3.2 经过碳酸钙和碳酸钠的联合降酸后，采用液质联用技术对花色苷组成及峰面积进行了测定，结果显示降酸前后的蓝靛果酒样品内均可以检测到 8种花色苷，即矢车菊素-3-己糖苷衍生物、芍药素-3,5-二己糖苷、矢车菊素-3,5-二己糖苷、芍药素-3-芸香苷、矢车菊素-3-乙酰基乙糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，但是这8种花色苷的总峰面积降低了19.92%，且各个花色苷的峰面积均发生了改变。其中，矢车菊素-3,5-二己糖苷和芍药素-3,5-二己糖苷的峰面积有所上升，特别是芍药素-3,5-二己糖苷的峰面积是降酸前峰面积的 10.42倍，其余6种花色苷峰面积均发生了不同程度的降低。