干化学法检测尿蛋白的影响因素分析

张 俊， 周芳芳， 徐 玮， 王 蕾

（1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200232；2.上海市第八人民医院，上海 200233；3.上海交通大学医学院检验系，上海 200025）

近年来，慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）在全球范围的发病率呈迅速增长趋势，国内外文献显示CKD患者数已占到人口总数的4.3%～7.0%[1-3]，其中有58.7%～89.7%的CKD患者是通过筛查发现的。尿蛋白是临床用于CKD筛查、诊断及治疗监测的重要指标。目前常用的筛查方法为尿干化学法，该法操作简单，可快速获得结果，但干扰因素较多。本研究针对尿蛋白干化学法检测的干扰因素设计模拟实验进行分析，评估尿蛋白干化学法出现假阳性或假阴性的原因。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2011年12月—2012年5月上海中医药大学附属龙华医院门诊及住院患者新鲜随机尿液标本2 500份（门诊患者标本1 300份，住院患者标本1 200份），及时检测，同时查阅并记录患者相关病史信息。

1.2 方法

1.2.1 尿蛋白定性检测 （1）尿干化学法：H-800全自动尿液分析仪（长春迪瑞公司）及配套试纸条。（2）磺基水杨酸法：在尿液标本中分别滴加1～2滴200 g/L磺基水杨酸溶液（安徽弘慈公司），肉眼观察结果，结果判定标准参照《全国临床检验操作规程》（第3版）。

1.2.2 尿蛋白定量检测 当2种定性检测方法测定结果不一致时，采用比色法定量检测尿蛋白，将定量检测结果作为判断标准。检测仪器为Modular P800全自动生化分析仪（瑞士罗氏公司），试剂由英国朗道公司提供。

1.2.3 潜血模拟实验 配制红细胞悬液，加入体检健康者尿液（尿蛋白阴性）中以模拟“红细胞尿”标本，依次对倍稀释，然后进行尿常规分析。

1.2.4 尿液放置4 h后pH值对干化学法检测尿蛋白的影响 （1）74份经测定pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白检测结果不同（包括阴性和阳性）的标本放置4 h后用干化学法检测尿蛋白；（2）将放置4 h后pH值改变的标本通过滴加弱酸（醋酸）调整pH值，恢复至正常范围（5.5～6.5）后再次测定尿蛋白，对照pH值调整前后的测定值，以排除放置时间对pH值的干扰。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。使用Excel 2007软件进行数据整理，方法学的比较采用配对χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干化学法与磺基水杨酸法尿蛋白检测结果的比较

在2 500份随机尿标本中，2种方法结果一致（包括相差一级）的有2 391份（95.64%），结果不一致的有109份（4.36%）。在836份尿蛋白阳性标本中，有19份干化学法阳性（1+～3+）、磺基水杨酸法阴性；有66份干化学法阴性、磺基水杨酸法阳性（1+～3+），见表1。2种方法的检测结果之间差异有统计学意义（χ2=2 021.51，P＜0.001）。

表1 干化学法与磺基水杨酸法尿蛋白检测结果的比较

2.2 干化学法出现假阳性结果的影响因素分析

对19份干化学法阳性（1+及以上）而磺基水杨酸法阴性的标本进行尿蛋白定量检测，结果全部为阴性，由此判定干化学法在检测这19份标本时出现了假阳性。对这19份尿标本的其他常规项目异常检测结果进行分类，其中潜血阳性13例（68%）、胆红素阳性1例（1.5%）、pH值＞6.5 5例（26.3%）、比重≥1.03 6例（31.6%）、尿沉渣红细胞增多7例（36.8%）。

2.3 潜血阳性（红细胞）对干化学法检测结果的影响

当尿液中红细胞计数≥1×105时，尿蛋白阴性的标本干化学法检测结果为阳性。见表2。

2.4 放置4 h后尿液pH值的改变对干化学法尿蛋白检测结果的影响

将74份pH值正常（5.5～6.5）但尿蛋白检测结果不同（阴性、±和1+）的标本放置4 h，所有标本的pH值均＞7.0。采用干化学法检测这74份标本的尿蛋白，有54份（72.97%）标本的尿蛋白结果出现变化。21份pH值为7.0～8.5的尿液标本，其尿蛋白结果的阳性程度均高于4 h前的测定值，出现了假阳性。32份pH值≥8.5的标本中有15份出现了假阴性，17份阳性标本中有5份标本出现了假阴性。

将54份出现结果改变的标本通过滴加弱酸（醋酸）的方式调整pH值至正常范围（5.5～6.5），发现其中40份尿液标本检测结果与初始结果一致。见表3。

表2 红细胞（不溶血）对尿蛋白结果的影响

表3 pH值对干化学法检测结果的影响

3 讨论

尿常规是临床上最常用的检验项目之一。正常人尿常规中的尿蛋白检测结果为阴性，当肾脏出现肾小球、肾小管疾病时，尿蛋白常呈持续异常升高。目前临床常用的定性检测尿蛋白的方法为干化学法。此法操作简便、快捷，但影响结果的因素较多。因此，本研究针对可能影响尿蛋白干化学法检测结果的因素设计模拟分析，深入探讨尿蛋白干化学法的影响因素。

本研究同时采用干化学法与磺基水杨酸法检测2 500份尿液标本，2种方法检测结果差异较大（P＜0.001），结果一致（包括相差一级）的有2 391份（95.64%），结果不一致的有109份（4.36%）。干化学法检测结果为阴性而磺基水杨酸法检测结果为阳性（1+～3+）的标本有66份。造成这种差异的原因可能与干化学法检测原理的局限性有关。干化学法利用指示剂误差原理[5]，以溴酚蓝为指示剂，其颜色的变化与结合的蛋白的量成正比，但溴酚蓝主要对白蛋白敏感，对球蛋白、低相对分子质量的蛋白质及免疫球蛋白轻链不敏感。而磺基水杨酸法不仅仅可以检测白蛋白，也能检测球蛋白、本周蛋白。有研究结果显示，干化学法主要检测尿液中的白蛋白，对于球蛋白等其他蛋白成分的敏感性较差，基本不与这些蛋白质发生反应；当尿中球蛋白 ＜4 000 mg/L时干化学法尿蛋白结果为阴性，只有当球蛋白达到5 500 mg/L时才出现阳性反应；对于白蛋白/球蛋白比值为1∶2的蛋白尿，蛋白浓度高达2 000 mg/L时才会出现阳性反应，测定球蛋白的敏感性仅为白蛋白的1/100～1/50[6]。对于低相对分子质量的蛋白尿或溢出性蛋白尿，干化学法多呈假阴性反应[7]。有研究结果显示，当大剂量青霉素静脉注射患者尿液中青霉素＞40 000 U/mL时，干化学法测定尿蛋白出现假阴性，而磺基水杨酸法出现假阳性[8]。出现此结果差异的主要原因是由于2种方法的反应原理不同。青霉素是一种有机弱酸，进入机体后，可以释放H+，改变环境的pH值，当用磺基水杨酸法检测尿蛋白时，外界环境的pH值低于等电点，促使尿液中蛋白质与磺基水杨酸更容易反应，增加沉淀物的析出。青霉素本身有类似蛋白质分子结构中的肽键，可与磺基水杨酸结合，产生沉淀。2种因素增加了沉淀物的析出，使磺基水杨酸法检测结果为假阳性或阳性程度高于干化学法。而当用干化学法检测尿蛋白时，酸碱指示剂产生阴离子与带阳离子的蛋白质结合生成复合物，但青霉素降低了环境的pH值，没有达到酸碱指示剂的缓冲范围，无法使指示剂发生颜色改变，导致检测结果为假阴性。

本研究设计了模拟实验分析造成干化学法假阳性结果的影响因素。结果显示当尿液中红细胞计数≥1×105时会出现假阳性结果，因此对于红细胞显著增多的不溶血的尿标本，尤其是肉眼血尿标本，当蛋白定性检测为阳性时不应盲目地根据尿蛋白定性结果判断肾脏损伤程度，应同时进行尿沉渣镜检、尿蛋白定量检测或其他检查加以辅助诊断[9]。此外，pH值对尿蛋白也有很大的影响，长时间放置会使尿液标本的pH值发生改变[10]。当尿液为碱性时，尿蛋白检测结果会出现假阳性。本研究结果显示，当pH值为7.0～8.5时干化学法易出现假阳性，而当pH值≥8.5时则可能出现假阴性。上述结果表明碱性尿对干化学法有明显的影响。这是由于该方法的“指示剂蛋白误差原理”需在恒定的酸性条件下进行，而碱性尿会改变pH值的缓冲环境，使检测结果易出现假阳性。当pH值≥8.5时出现假阴性的原因可能是由于在该pH值的条件下已超过了干化学法指示剂的缓冲范围，导致无法产生显色反应所致。一些药物如奎宁、奎宁丁和嘧啶等均会使尿液呈强碱性（pH值≥9.0），导致干化学法尿蛋白检测结果出现假阴性。

综上所述，尿液中红细胞的存在、pH值过高或过低以及药物等影响都可能使干化学法出现与实际不符的结果。临床上应对尿蛋白结果综合进行分析，以免造成漏检和误诊。