健脾解毒方对胃癌细胞凋亡及基因调控机制的研究

魏征，李亚峰，梁瑞峰，张俊萍

河南省中医药研究院，河南 郑州 450004

流行病学调查研究表明我国胃癌患者发病及死亡人数已占全球胃癌病患总人数的50%，其发病率和死亡率分别位于我国恶性肿瘤疾病的第二位和第三位[1]，我国每年新发病例约40万例，占世界总发病例数的42%。据报道，至2015年胃癌成为中国癌症发病率和死亡率首位的恶性肿瘤[2]。因此，探讨胃癌凋亡机理，寻找治疗胃癌有效途径是目前胃癌研究的一项重要课题。中药治疗肿瘤有疗效确切、副作用少等无可比拟的优势[3]。中医治疗胃癌也由单纯临床报道进入了较为系统的临床与实验相结合的前瞻性研究，并且开始从分子机制揭示中药治疗胃癌的机制。随着分子生物学的进展，国内外在肿瘤凋亡研究上取得了较大进展，凋亡受抑制是肿瘤发生发展中重要的病理现象，与肿瘤的治疗密切相关[4～5]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是设计治疗方案的重要思路。然而健脾解毒中药能否参与凋亡相关线粒体通路与死亡受体通路这一科学问题仍未解决，因此这也是本课题将要探索的方向。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人胃癌细胞株SGC-7901购于中科院上海细胞库。

1.2 试剂和仪器 健脾解毒方，药物组成：党参15 g，白术、半枝莲、八月札各10 g，当归8 g，薏苡仁12 g，甘草5 g，生黄芪36 g。由河南省中医药研究院自制为片剂，用研钵捣成粉末，用DMSO配置浓度为100 mg/mL的母液备用。Thermo CO2培养箱；荧光定量PCR仪Roto-gene 6000(Corbett Research)，PCR 扩增仪 2720 Thermal Cycler(Appiled Biosystem)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，美国Sigma公司)；DMEM培养基(杭州四季青公司)；B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cytochrome c)、自杀相关因子(Factor associated suicide，Fas)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)兔抗鼠抗体(Santacruze公司)；总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(日本 Takara公司)；Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8引物(上海生工生物工程有限公司)；化学发光试剂盒、化学发光成像仪(Tanon公司)。

1.3 MTT法检测细胞活性 96孔板接种对数生长期SGC-7901细胞，接种浓度是5×104个/mL，以10、20、40μg/mL健脾解毒方分别作用于胃癌SGC-7901细胞24 h，加入MTT(1 mg/mL)，37℃，4 h，加入100μL DMSO，酶标仪于570 nm处测吸光度。相对抑制率(%)=(1-给药组吸光值/对照组吸光值)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 6孔板培养SGC-7901细胞，24 h后加入健脾解毒方(浓度分别为10、20、40μg/mL)，加药24 h后，收集细胞，AnnexinⅤ/PI染色，室温下30 min，流式细胞仪检测。

1.5 JC-1染色检测线粒体膜电位 酶标仪检测方法：将对数生长期的SGC-7901细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化、计数，按每孔5×104个/mL的细胞密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24 h后，以10、20、40μg/mL的健脾解毒方处理SGC-7901细胞24 h，用PBS清洗细胞2次，5μg/mL JC-1染料37℃孵育细胞30 min。然后用PBS清洗细胞2次，用荧光酶标仪定量分析。JC-1染料的激发光波长为488 nm，发射光波长为535 nm和595 nm。

1.6 qRT-PCR检测SGC-7901中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA的表达 用6孔板培养SGC-7901细胞，24 h后加入健脾解毒方(浓度分别为10、20、40μg/mL)，加药24 h后，吸掉培养基，PBS洗3次，加入500μL/孔的Trizol，摇晃均匀，静置5 min后反复吹打，收集细胞后转移至1.5 mL离心管中加入Trizol反复抽吸均匀，离心管中加入Trizol总体积的1/5量的氯仿，振荡混匀30 s，室温下静置5 min，4℃条件下12 000×g离心15 min，分相为三层，上层清液为RNA(约为Trizol的60%)。小心吸取上清液，转移到另一个1.5 mL离心管中，有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，上清液加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒混匀30 s。4℃静置30 min，4℃条件下14 000×g离心15 min，RNA沉淀将在离心管底部形成。小心弃去上清液，离心管加入1 mL预冷的75%乙醇-25%DEPC-H2O振荡混匀30 s，使沉淀振荡起来，4℃条件下16 000×g离心15 min。小心弃去上清液，防止RNA沉淀丢失，倒置离心管于滤纸上，干燥RNA，但不能完全干燥(10～20 min)。用DEPC水10μL溶解沉淀，反复吹打使其溶解。(注：RNA干燥后呈无色透明片状，用水溶解后注意仔细淋洗离心管底部)，测量OD值后，样品放置-70℃保存，保质期一个月用逆转录酶逆转录得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1)。PCR扩增反应条件为：Bax、Cytochromec、Fas、Caspase 8 95℃，预变性 5 min；95℃，变性 10 s；60℃，退火 30 s，72℃，延伸30 s，重复40个循环。数据处理采用2-ΔΔCt法，分析目的基因mRNA的相对表达量。

表1 检测引物序列

1.7 Western-blot检测Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 蛋白表达 6孔板培养SGC-7901细胞，用健脾解毒方(浓度分别为10、20、40μg/mL)处理SGC-7901细胞 24 h，收集细胞，离心5 min，PBS洗3次，每毫升加入100μL的细胞裂解液，置冰上裂解20 min，12 000×g离心6 min，取上清液，取等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将分离的蛋白转移到PVNF膜上，封闭液封闭1 h后，加入1抗于室温2 h后，用TBST洗涤3次，加入2抗温育1 h，最后用化学发光试剂盒显色，发光成像仪记录结果。

1.8 统计学方法 数据分析采用Graphpad Prism 6.0数据统计软件，单因素方差分析(one-way ANOVA)，计量资料以(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度健脾解毒方对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用见表2，图1。与对照组比较，20、40μg/mL健脾解毒方细胞抑制率较高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，并且呈剂量依赖性。倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，与对照组比较，10 μg/mL的健脾解毒方处理24 h后，SGC-7901细胞形态学未有明显改变；20μg/mL的健脾解毒方处理24 h后，SGC-7901细胞形态学发生改变，细胞变圆；40μg/mL的健脾解毒方处理后的细胞皱缩，数目明显减少。

表2 不同浓度健脾解毒方对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用(±s)

表2 不同浓度健脾解毒方对胃癌SGC-7901细胞的抑制作用(±s)

与对照组比较，①P＜0.05

组 别对照组健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3抑制率(%)-2 0.9 2±1.4 2 5 1.6 5±0.5 2①6 7.7 5±1.0 2①

图1 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901细胞24 h形态的改变（×100）

2.2 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901细胞凋亡的影响 见表3，图2。10、20、40μg/mL健脾解毒方处理SGC-7901细胞后，分别有5.98%、14.94%和31.88%细胞出现凋亡。与对照组比较，10、20、40μg/mL健脾解毒方组细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)，并呈浓度依赖性，表明健脾解毒方能够诱导SGC-7901细胞发生凋亡。

表3 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901细胞凋亡的影响(±s)

表3 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901细胞凋亡的影响(±s)

与对照组比较，①P＜0.05

组 别对照组健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3细胞凋亡率(%)2.5 2±0.6 2 5.9 8±1.0 9①1 4.9 4±0.6 2①3 1.8 8±0.3 1①

图2 细胞凋亡率流式细胞仪检测结果

2.3 不同浓度健脾解毒方作用24 h后对线粒体膜电位的影响见表4，图3。随着健脾解毒方浓度的增加，SGC-7901细胞的线粒体膜电位呈浓度依赖性下降(P＜0.05)。荧光酶标仪测定结果显示，不同浓度健脾解毒方给药处理24 h后能够降低细胞线粒体红绿荧光比值。与对照组比较，不同浓度健脾解毒方处理SGC-7901细胞24 h后，细胞中JC-1单体形式逐渐增多，说明了线粒体膜电位下降，在40μg/mL健脾解毒方处理时线粒体膜电位下降最明显。

表4 不同浓度健脾解毒方作用24 h后对线粒体膜电位的影响(±s) %

表4 不同浓度健脾解毒方作用24 h后对线粒体膜电位的影响(±s) %

与对照组比较，①P＜0.05

组别对照组健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 J C-1单体(r e d/g r e e n)1 0 0 9 7.7 2±0.5 9 7 9.6 4±0.5 5①4 5.1 2±1.0 1①

图3 不同浓度健脾解毒方作用24 h后对线粒体膜电位的影响 (×400)

2.4 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表达的影响 见表5。与对照组比较，10、20、40μg/mL健脾解毒方处理SGC-7901细胞24 h后，SGC-7901细胞中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的基因表达明显升高(P＜0.05，P＜0.01)，并呈剂量依赖性。

表5 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表达的影响(±s)

表5 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表达的影响(±s)

与对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组 别对照组健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.4 7±0.1 3①1.6 6±0.3 2①3.2 5±0.4 8②C y t o c h r o m e c 1 1.2 3±0.6 2①2.3 7±0.5 7①3.1 6±0.3 9②F a s 1 1.1 8±0.3 7①1.9 2±0.5 8①2.7 8±0.3 3②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6①2.3 6±0.5 1①3.3 8±0.1 9②

2.5 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表达的影响 见表6，图4。20、40 μg/mL健脾解毒方处理SGC-7901细胞24 h后，随着药物浓度的增加，Bax、Cytochromec、Fas、Caspase-8蛋白表达含量也增加(P＜0.05，P＜0.01)，且呈浓度依赖性。说明该药物通过增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的蛋白表达，来诱导细胞凋亡。

表6 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表达的影响(±s)

表6 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表达的影响(±s)

与对照组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组 别对照组健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.1 8±0.2 1①1.6 9±0.4 2①2.4 1±0.5 5②C y t o c h r o m e c 1 1.3 4±0.7 6①2.7 3±0.6 6①4.5 7±0.5 3②F a s 1 1.3 8±0.4 1①2.6 2±0.4 9①3.8 2±0.5 8②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6 1.3 7±0.4 2①1.6 3±0.2 6①

图4 不同浓度健脾解毒方对SGC-7901细胞中蛋白表达的影响

3 讨论

目前对于胃癌不适于手术或放化疗治疗的患者，采用保守治疗，无论中药还是西药，其作用机制的研究都已经取得了很大的进展，总结起来主要有以下几个方面：直接抑制肿瘤细胞的生长[6]；调节机体的免疫功能[7]；诱导肿瘤细胞凋亡和分化[8]；调控胃癌基因的表达[9]；活化肿瘤细胞信号通路[10]。其中关于细胞凋亡与线粒体通路、死亡受体信号通路的研究是目前的研究热点，众多治疗胃癌的有效中药的作用机制也与以上两方面有密切关系[11～13]。由此可见，线粒体通路、死亡受体信号通路参与细胞凋亡，在胃癌的治疗上有举足轻重的地位。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是由机体内外环境变化或死亡信号触发，在基因调控下引起细胞主动死亡的过程，既是生物体维持自身稳定和平衡的一个重要机制，也是消除异常增殖细胞的理想途径，该途径紊乱将导致细胞发育异常和加速肿瘤的发生和恶化[14]。目前认为细胞凋亡信号通路包括2条：(1)线粒体信号通路：许多凋亡信号通过进入线粒体，诱导线粒体内的Cytochrome c等小分子释放到胞浆，活化Caspase-9，活化的Caspase-9切割pro-caspase-3生成Caspase-3，从而诱导凋亡[15]；(2)死亡受体信号通路：一些凋亡刺激因素激活细胞膜外死亡受体，死亡受体进一步活化膜上Fas相关的死亡结构域，结合并活化半活化Caspase-8，活化的Caspase-8进一步切割pro-caspase-3生成Caspase-3，从而诱导凋亡[16]。在细胞凋亡通路中，线粒体扮演着重要角色，表现在：(1)释放Caspases激活因子如Cytochrome c[17]；(2)丧失电子传递链功能，ATP生成减少，细胞能量不平衡[18]；(3)线粒体膜电位消失，诱导细胞凋亡的产生[19]；(4)承载Bcl-2家族蛋白调节细胞凋亡[17]。其中线粒体释放Cytochrome-c，是Caspases自身正反馈激活链中关键步骤。Fas是该死亡区域的重要受体之一，FasL是同源三聚体分子，活化后通过“死亡结构域”与接头分子Fas相关死亡域蛋白(Fas-assoeiated death domain，FADD)结合而引起FADD构象变化，进而募集Caspase-8、Caspase-10形成复合物 DISC(death-inducing signaling complex)引 起 Caspase-8、Caspase-10自身剪切激活，启动下游Caspase的级联反应，激活Caspase-6、Caspase-3、Caspase-7引发了细胞凋亡[20]。本实验研究发现健脾解毒方能够通过增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的表达来诱导细胞凋亡。

实验研究结果显示：健脾解毒方在40μg/mL浓度能够有效的降低SGC-7901细胞线粒体膜电位，影响线粒体正常功能，并通过增加Cytochrome c的释放、刺激Fas蛋白的表达、激活Caspase-8的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达来诱导细胞发生凋亡，显示健脾解毒方可能通过线粒体介导细胞凋亡途径来发挥抗肿瘤的作用。