血栓素A2及PI3K/AKT信号通路在早发型子痫前期的作用研究

侯敬，李斯宁，张玉芳，梁爽，张秀荣，张义，朱艳菊

(1.承德医学院附属医院 妇产科，河北 承德 067000;2.承德医学院附属医院 骨科，河北 承德 067000)

子痫前期是妊娠期特有的严重威胁孕妇和围产儿健康状况，且直接影响妊娠结局的疾病，其发病数占妊娠总数的5%～10%[1- 2]。子痫前期主要特点为妊娠大于等于20周后出现异常的机体血压升高、蛋白尿和炎症因子升高。患有子痫前期的孕妇易发小血管全身性痉挛、内皮细胞的大量损伤和局部的身体缺血，严重时可累及机体的多个重要脏器，甚至引发孕妇和围产儿的死亡[3- 4]。据报道，子痫前期的发病时间越早，围生儿的病死率则越高。有研究表明，子痫前期孕妇体内的胎盘血流灌注不足、炎症因子及有害物质的释放和氧化应激状态与胎盘中血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)有关，TXA2具有强烈收缩血管的功能，并能有效增加血管紧张素Ⅱ的敏感性，进而引发母体血压升高和临床蛋白尿等[5- 6]。TXA2同时也能够激活磷脂酰肌醇3- 激酶(phosphoinositide 3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路，介导机体的炎症反应，调控细胞的凋亡发生。本研究通过选取本院2015年5月至2017年5月收治的子痫前期孕妇和正常孕妇的血清和胎盘组织，检测TXA2的表达，探讨PI3K/AKT信号通路在此过程中的重要作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取60例子痫前期单胎孕妇作为观察组，患者平均年龄(25.67±2.23)岁，发病孕周(26.41±3.15)周。选取正常孕妇30例为对照组，平均年龄(25.72±2.18)岁，平均孕周(26.33±3.24)周。子痫前期诊断标准依据参2011年威廉姆斯产科学(第23版)[7]。本研究经本院伦理委员会批准，患者家属自愿签署知情同意书。观察组和对照组均无其他妊娠内外科相关疾病和并发症；患者无冠心病、脑梗死、其他内分泌系统疾病、精神疾病、肿瘤、自身免疫性或遗传性疾病等。

1.2 血液检测方法

收集观察组和对照组孕妇清晨空腹血液6 ml，2 000 r·min-1低温离心15 mim，常规分离血清，收集待测。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清TXA2、PI3K和AKT含量，试剂盒购于美国R&D公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 胎盘取材

观察组和对照组孕妇自然分娩或手术分娩后取出娩出胎盘，避开坏死及钙化区，在胎盘脐带附着处取约为1 cm3母体面全层胎盘组织，用PBS反复进行漂洗后放于甲醛溶液(10%)中固定并进行石蜡包埋。或取出相应组织置于液氮中，进行下一步RNA或蛋白提取。

1.4 免疫组织化学法检测TXA2蛋白表达水平

取孕妇胎盘石蜡标本用5%血清室温封闭40 min后，分别加入1∶1 000的TXA2单克隆抗体4 ℃过夜孵育。隔天加入二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗，加入SP后恒温反应持续30 min，加入DAB显色液进行显色，中性树胶封片后用10、40倍物镜显微镜进行观察。TXA2的阳性表达主要表现为孕妇胎盘组织细胞切片内检测到棕黄色的颗粒。切片随机选择6个高倍镜视野(×400)进行计数，计算孕妇胎盘组织中TXA2蛋白表达的平均光密度(mean density)。

1.5 Caspase 3活性检测

取胎盘组织冰上裂解，4 ℃离心后收集胎盘组织的上清液。96孔板中加入缓冲液稀释好的蛋白样本50 μl和LEHD- pNA底物5 μl 37 ℃孵育1 h，每个样本重复3孔，其吸光值(OD值)在酶标仪405 nm处进行测定。Caspase- 3活性=(各实验组OD值-调零组OD值)/标准曲线斜率。

1.6 Western blotting检测TXA2、PI3K和AKT蛋白表达水平

取胎盘组织冰上裂解2 h，蛋白浓度采用BCA试剂盒进行测定，调整各组蛋白浓度总量为30 μg·μl-1。将观察组和对照组孕妇胎盘蛋白样品加入到聚丙烯酰胺凝胶中(10% SDS)进行电泳和转膜，加入多克隆抗体TXA2、PI3K、AKT一抗(一抗均以1∶5 000稀释)和辣根过氧化物酶二抗(以1∶1 000稀释)。显色法采用ECL显色，蛋白表达灰度扫描用Bio- Pro凝胶成像分析仪，Quantity- one软件进行相应蛋白含量的测定。

1.7 Real- time PCR检测TXA2、PI3K和AKT mRNA表达量

采用Real- time荧光定量PCR法测定TXA2、PI3K和AKT mRNA表达量。胎盘组织RNA用Trizol法提取，用含有GDNA Eraser的试剂盒进行cDNA的合成和逆转录，严格按照说明书进行荧光定量分析，采用SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒进行Real- time PCR实验操作。采用相对定量阈值循环数(cycle threshold, CT)值法计算不同样本的相对表达量。公式:ΔΔCT=(CT实验组的基因-CT实验组管家基因)-(CT对照组目的基因-CT对照组管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 血液指标检测结果

与对照组相比，观察组患者血清TXA2、PI3K、AKT含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

与对照组比较，aP<0.05

2.2 Caspase 3活性检测结果

与对照组相比，观察组患者胎盘组织内Caspase 3活性明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.3 TXA2、PI3K和AKT蛋白表达水平

与对照组相比，观察组患者血清TXA2、PI3K和AKT蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4 TXA2、PI3K和AKT mRNA表达水平

与对照组相比，观察组患者血清TXA2、PI3K和AKT mRNA表达水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

与对照组相比，aP<0.05

图1Caspase3活性检测结果

与对照组相比，aP<0.05

图2TXA2、PI3K和AKT蛋白表达含量

2.5 TXA2免疫组化结果

与对照组TXA2蛋白平均光密度(1.34±0.42)相比，观察组患者胎盘组织内TXA2蛋白平均光密度水平(1.86±0.39)明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

子痫前期是严重威胁孕妇和围产儿健康的常见孕期并发症。目前认为子宫内滋养细胞侵袭异常和子宫螺旋动脉重铸不足是子痫前期发病的第一阶段，此过程可以直接导致孕妇子痫前期发病第二阶段的胎盘血流灌注不足和机体缺血缺氧的氧化应激状态[8- 9]。早发型子痫前期起病早、收缩压及舒张压同时升高，随着疾病进展，常常表现为严重的高血压(≥160/110 mmHg)，且血压增高幅度较大。同时，病理性的胎盘可以释放炎症介质和毒性因子，并通过血液循环进入母体和胎儿体内，损伤大量的孕妇血管内皮细胞，并伴随全身性的炎症反应，进而导致母体临床高血压和蛋白尿等症状和体征。早发型子痫前期孕妇常伴有头痛、视觉障碍、踺反射亢进、血小板减少、肝肾功能异常、胎盘早剥、HELLP综合征、胎儿宫内窘迫、胎死宫内等严重并发症。研究表明，子痫前期患者内皮细胞受损、凝血功能异常是引起胎儿生长发育迟缓，造成孕妇不良妊娠结局的重要原因。妊娠中晚期时，孕妇血中的雌激素水平显著升高，机体内血小板和凝血因子的数量增加，血小板的大量聚集使血管的黏附性增强，抑制体内抗凝血酶的作用，血液处于高凝状态。

与对照组相比，aP<0.05

图3TXA2、PI3K和AKTmRNA表达含量

血栓素合酶(thromboxane synthase, TXS)是血小板中发现的微粒体酶，在肺脏、肾脏、胃、脾和结肠等组织内广泛表达[10- 11]。当机体发生应激状态时，TXS可催化TXA2激活，参与机体炎症反应和氧化应激反应。TXA2具有强烈的血管收缩功能，并能使血管紧张素Ⅱ的敏感性增强，进而引发母体血压升高和临床蛋白尿等。TXA2可通过活化特定G- 蛋白偶联血栓素受体(thromboxane receptor, TPr)调节信号级联反应，进而调节机体内的细胞黏附情况、细胞运动情况、细胞增殖存活情况和细胞凋亡情况等[12- 13]。TXA2同时也能够激活PI3K/AKT信号通路，介导机体的炎症反应、调控细胞凋亡的发生，参与调节机体的病理生理状态。PI3K/AKT作为一种磷脂酰肌醇激酶级联通路，参与调节细胞生长、细胞骨架重塑和细胞凋亡等[14]。PI3K激活后可通过脂质底物磷酸化活化下游AKT，并对其下游靶蛋白mTOR、NF- κB和Caspase 3等进行磷酸化的激活或抑制，介导胰岛素、多种生长因子等诱发细胞生长，调节细胞凋亡与代谢过程[14- 15]。

本实验通过检测观察组和对照组的孕妇血清细胞因子含量发现，观察组患者血清TXA2、PI3K、AKT含量明显升高，说明子痫前期孕妇体内TXA2显著表达，与PI3K和AKT共同参与子痫前期的生理过程。免疫组化结果显示，早发型子痫前期孕妇胎盘内TXA2表达显著增加，明显高于正常孕妇胎盘内TXA2的含量，TXA2在早发型子痫前期孕妇体内起到重要的作用，参与调节下游的细胞信号转导的生理病理过程。与对照组相比，观察组患者胎盘组织内TXA2、PI3K及AKT蛋白和mRNA表达水平明显升高，Caspase 3活性显著升高，说明与正常妊娠孕妇相比，子痫前期孕妇体内和胎盘内TXA2被大量释放入血，PI3K/AKT信号通路被激活，参与调节细胞凋亡蛋白的表达，进而在早发型子痫前期患者体内起到重要的调控作用。

综上所述，TXA2可以通过调节PI3K/AKT信号通路参与调控早发型子痫前期患者体内的病理生理过程，对于治疗和控制早发型子痫前期、减少孕妇和胎儿的病死率具有重要的临床意义。