摘叶处理对黑穗醋栗叶片和果实AsA-GSH循环代谢的影响

刘庆帅,孙小娟,李芳晓,秦 栋,霍俊伟

(东北农业大学园艺园林学院 寒地小浆果开发利用国家地方联合工程研究中心,哈尔滨 150030)

抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）是人类必须从食物中摄取的一种小分子物质，具有极好的抗氧化性，在防治坏血病、参与造血、促进胶原蛋白的合成、治疗哮喘、抗肿瘤[2]等方面有着良好的医疗价值。在植物内它不仅能清除自由基，还作为某些还原酶的辅因子参与还原反应，而且在调节植物生长、诱导开花、延缓衰老、促进细胞分裂、碳氮代谢、信号的转导和传递等多种生理调控过程中起着重要作用。L-半乳糖途径是大多数植物中抗坏血酸生物合成的主要途径，这在苹果、葡萄、刺梨、番茄和猕猴桃等园艺作物上已得到验证。抗坏血酸-谷胱甘肽（ascorbateglutathione，AsA-GSH）循环是AsA再生途径之一，其在黑穗醋栗果实中AsA积累中的作用已被证实。

黑穗醋栗（Ribes nigrum L.）属虎耳草科（Saxifragaceae）茶藨子属落叶丛生灌木，果实为黑色浆果，有光泽，近球形，味酸甜，清香，营养价值丰富，以富含高水平的AsA而著称，其含量高达200～400 mg/100g FW，是苹果和草莓的几十倍，是重要的AsA植物源，由其制成的果酱、果酒、饮料等无公害或绿色食品备受欢迎。

本课题组前期研究表明，黑穗醋栗不同品种果实AsA含量不同，存在明显差异，AsA的含量与抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性呈正相关，同时还发现，黑穗醋栗果实AsA含量高的品种，其叶片AsA含量也高（见表1），但一旦果实坐果，叶片AsA含量有明显的下降过程，果实和叶片中AsA的关系如何？是否存在长距离运输？这些还都需要进一步探讨。

现有研究表明植物叶片等源器官自身具备完整的AsA合成途径，但由于AsA长距离运输理论的提出，使植物库器官中AsA形成机制变得复杂化，尤其对葡萄、苹果、梨、越橘等低AsA含量的水果是否具有AsA的合成能力，及其组织间的差异是研究果实AsA积累机制的基础，这也是提高果实AsA水平的前提。用喂饲拟南芥和紫花苜稽后，发现AsA可以从叶片经过韧皮部向芽、花和根进行长距离运输；AsA转运参与了刺梨果实中AsA的积累，但刺梨除了果实外，其他各组织器官中DHA含量均较高，但叶片中的AsA和DHA的浓度相对其他叶柄和枝条更高一些，所以猜测刺梨也有可能以叶片为合成的源头，把氧化产物长距离运输到果实中；番茄的同位素标记实验表明，番茄植株的AsA从叶片运出后大都积累在绿色未成熟的果实中，而在成熟果实中没有积累。此外，植物中还存在不同组织器官间的AsA的长距离运输，通过输导组织调节库和源组织中AsA的分布，然而长距离运输对组织器官AsA积累作用程度目前还没有明确的定论。这些研究表明，通过长距离运输积累AsA的途径，不仅在器官和组织间存在差异，也因物种的不同而有所差异。

为了进一步研究黑穗醋栗果实中AsA与叶片中AsA含量的关系，我们进行了摘果试验，在黑穗醋栗果实开始坐果时，摘去50%果实（总坐果量的50%），探讨了摘果处理对AsA含量及AsA-GSH循环的影响，结果表明：摘果处理后能显著增加果实中AsA的含量，但叶片中AsA含量有所减少。而摘果处理组枝条果实中AsA含量的增加与减少与自身AsA的再生循环没有太大联系，可能受枝条总的叶片中AsA含量的影响。但叶片减少是否也像摘果处理那样影响果实AsA含量及AsA-GSH代谢循环？至今还未见详细报道。

因此，为了全面揭示黑穗醋栗果实中AsA合成积累的机理，本次实验进行摘叶处理，探讨摘叶处理对叶片和果实AsA含量及AsA-GSH代谢循环的影响，也为未来选育高含量AsA加工专用新品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为8年生生长势相对一致，但果实AsA含量差异显著的3个栽培品种：亚德、布劳德和利桑佳，其果实和叶片AsA含量见表1；试材定植于东北农业大学黑穗醋栗种质资源圃内，管理水平中等。

表1 黑穗醋栗品种及AsA含量（±标准差）

1.2 摘叶处理

在黑穗醋栗果实开始坐果（5月初）时，在每个品种的单株上选取生长势一致，结果数以及叶片数基本一致的两个枝条，对其中1条进行摘叶处理，去除其50%的叶片，另外一个枝条做对照，每个品种处理30个单株，每次采样后保证处理枝条的叶片始终是对照枝条总叶片数的50%左右。每隔7天进行一次采样，直至果实成熟，共采样8次。每次取样后，当天或第二天测量部分新鲜果实和叶片样品中的AsA含量，其余果实和叶片经液氮冷冻后，贮存于-80℃冰箱，用于相关酶活性测定。

1.3 测定方法

AsA含量的测定采用高效液相色谱法。T-AsA、DHA含量的测定参考Kampfenkel的方法。APX、MDHAR、DHAR、GR活性测定分别参考Asada 以及Ma 和 Cheng的方法，GSH和GSSG含量的测定参考Griffith的方法。以上测定均重复3次。

图1 3个不同黑穗醋栗品种坐果后1-8周果实形态变化

1.4 统计分析

用Execl数据处理，并作图，用DPS9.5软件进行显著性检验分析。

在数据处理及结果分析中，未摘叶处理（对照组）叶片、未摘叶处理（对照组）果实、摘叶处理（处理组）叶片和摘叶处理（处理组）果实分别记为CL、CF、TL和TF。

2 结果与分析

2.1 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实AsA含量的影响

无论是高AsA含量品种亚德，还是低AsA含量品种利桑佳，其叶片和果实的AsA含量变化趋势相同（图2A-C），均是随着果实的发育而增加，在第3周达到最大值，‘亚德’、‘布劳德’和‘利桑佳’每100 g鲜重果实中的AsA含量分别为424.03 mg、256.97 mg和274.96 mg；叶片中的AsA含量分别为122.36 mg、81.07 mg和70.04 mg；随后由于果实的膨大（图1）而有所下降，在果实着色期和成熟期（第5～8周）趋于稳定。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理明显增加了处理组叶片中AsA含量，且差异极显著（p＜0.01），在第3周，亚德品种摘叶处理组叶片的AsA含量是对照的1.31倍；摘叶处理对果实中AsA含量的影响与叶片相反，摘叶处理组中，果实AsA含量明显低于对照，且差异极显著（p＜0.01），在第3周，利桑佳果实中AsA含量是对照的0.87倍；这可能是随着叶片的相对减少，果实中的AsA含量相对减少，但反过来可能也促进了叶片中AsA的合成。

图2 3个黑穗醋栗品种摘叶处理与对照组抗坏血酸含量比较

2.2 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实GSH含量及GSH/GSSG的影响

3个黑穗醋栗品种果实中GSH的含量在整个果实发育期内无显著性变化（以布劳德为例）。在坐果后第一周，果实中GSH含量比较低，随后略有上升至第3周，然后缓慢下降，下降幅度不大（图3A）。摘叶处理后，对照组与处理组果实中GSH含量无显著性差异（p＞0.05），表明叶片的相对减少，对果实中GSH含量没有显著性的影响。

3个黑穗醋栗品种叶片中GSH的含量在整个试验周期呈现先上升后下降的趋势（以布劳德为例）。在坐果后第1周含量最低（15.93 mg/100g），随后迅速上升，在第3周达到峰值（34.02 mg/100g），是第1周的2.13倍，随后由于果实的膨大而有所下降，在果实着色期和成熟期（第5～8周）趋于平稳，与果实内AsA含量变化趋势相似。

GSH/GSSG比值用来衡量谷胱甘肽的氧化还原状态，通常使用GSH/GSSG比值的变化来表明AsA-GSH循环在AsA的生成中起重要作用。随着果实的发育，果实中GSH/GSSG比值呈缓慢上升的趋势（图3B），而叶片中GSH/GSSG值变化幅度较大，但始终低于同期果实中的比值（图3B）。叶片中GSH/GSSG值的变化趋势与叶片中AsA含量的变化同步，在坐果后1周比值最低，随着果实的发育，呈现先上升后下降的趋势，在第3周达到峰值，为第1周的4.7倍，然后逐渐下降，下降至第8周为1.9，与第1周GSH/GSSG值相差不大。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理增大了处理组叶片中GSH/GSSG值，第4周相差最大，差值为0.5；但摘叶处理对果实中GSH/GSSG值的影响不大。这表明叶片的相对减少对叶片中AsA-GSH循环有一定的影响。

2.3 摘叶处理对黑穗醋栗叶片及果实AsA-GSH循环相关酶活性的影响

图3 布劳德GSH的含量及GSH/GSSG的比值

图4-A 亚德摘叶处理与对照中APX活性的比较

图4-B 布劳德摘叶处理与对照中APX活性的比较

图4-C 利桑佳摘叶处理与对照中APX活性的比较

APX是植物体内利用AsA作为电子供体清除H2O2的酶，清除的同时使AsA氧化成MDHA。3个黑穗醋栗品种内APX酶活性变化趋势相同（图4A-C），但每个品种叶片和果实内酶活性的变化存在差异。在果实中，APX活性初期活性较高，之后随着果实的发育，呈下降趋势（图4A-C），其中1～3周下降幅度较大，4～8周酶活性起伏变化不大，这与果实中AsA含量变化趋势正好相反。而在叶片中，酶活性在1～2周先下降，随后迅速上升至第3周达到峰值，‘亚德’、‘布劳德’和‘利桑佳’叶片中的APX活性分别为39.35 U/g、36.37 U/g和33.57 U/g；随后由于果实的膨大而有所下降，但在果实的成熟期（第7～8周）有轻微上升。

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理增加了处理组果实中APX活性，在第3周，亚德品种处理组果实的酶活性是对照组的1.12倍；摘叶处理对叶片中APX活性的影响与果实相反，处理组中，叶片中的酶活性低于对照，在第3周，利桑佳品种叶片中APX活性是对照的0.93倍；这可能是由于叶片的减少，导致叶片中APX活性降低，但反过来促进了果实中APX活性的升高。

DHAR作为AsA再生系统中关键酶，能将氧化态的DHA还原成AsA。3个黑穗醋栗品种中DHAR活性的高低与AsA含量成正比，但无论是高AsA含量品种亚德，还是低AsA含量品种利桑佳，其DHAR活性的变化趋势相同（图5A-C），均随着果实的发育呈现先增加后下降的趋势，但与AsA含量变化不同的是，其酶活性在坐果后第4周达到峰值（滞后1周），‘亚德’、‘布劳德’和‘利桑佳’果实中DHAR活性分别为46.71 U/g、42.68 U/g和34.58 U/g；叶片中DHAR活性分别为56.22 U/g、53.79 U/g和49.48 U/g；随后由于果实的膨大而有所下降，在果实成熟期（第7～8周）趋于稳定。

图5-A 亚德摘叶处理与对照DHAR活性比较

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理对处理组果实中DHAR活性无显著性影响；而叶片中，处理组叶片中DHAR活性始终高于同期对照组叶片酶活性，且AsA越高，差异越显著（p＜0.05）。从而说明，摘叶处理对叶片中DHAR活性有一定的影响，但对果实中DHAR活性的影响不大。

MDHAR能将氧化态的MDH还原成AsA，是AsA-GSH循环中的关键酶之一。3个黑穗醋栗品种中MDHAR活性变化趋势相同，因此用布劳德代表所有这3个品种。果实和叶片中MDHAR活性均呈先上升后下降趋势，在第4周达到峰值（图6），‘布劳德’果实和叶片中MDHAR活性分别为19.64 U/g和24.37 U/g。与未摘叶处理（对照）相比，处理组果实中MDHAR活性有所降低，而处理组叶片中MDHAR活性有所升高。

GR对GSH的氧化还原状态和植物的抗逆性有着重要的作用，可将GSSG还原成GSH。随着果实的发育，3个品种中GR活性的变化趋势相似，再次以布劳德为例。自坐果后，GR活性随着果实的发育，呈下降趋势（图7），其中1～3周下降幅度较大，4～8周酶活性起伏变化不大趋于稳定，与果实中APX活性变化趋势相同。而在叶片中，酶活性在1～3周迅速上升至第3周达到峰值（26.03 U/g），随后由于果实的膨大而有所下降，但在果实的着色期和成熟期（第5～8周）趋于稳定。

图5-B 布劳德摘叶处理与对照DHAR活性比较

图5-C 利桑佳摘叶处理与对照DHAR活性比较

图6 布劳德摘叶处理与对照MDHAR活性比较

图7 布劳德摘叶处理与对照组GR活性比较

与未摘叶处理（对照）相比，摘叶处理降低了处理组果实中GR的活性，但无显著性差异（p＞0.05）；而叶片中，摘叶处理明显地增加了处理组第3周叶片中GR的活性，且差异显著（p＜0.05），第3周时处理组叶片中GR的活性是对照组的1.1倍，而其他坐果时期差异不显著。

3 讨论与结论

AsA是植物体内一种重要的非酶抗氧化剂和氧化还原物质，在清除活性氧自由基及抗氧化方面具有非常重要的生理功能。目前，对猕猴桃、刺梨、苹果、葡萄、枣和酸枣等园艺作物的AsA生物合成和代谢途径进行了深入研究，对引起高等植物抗坏血酸含量差异的主要因素进行了探讨。随着对高等植物中 AsA生物合成和代谢途径的深入了解，特别是明确了AsA生物合成的 L-半乳糖途径和AsA-GSH循环再生途径后。通过研究AsA 含量与AsA-GSH循环再生途径相关的酶活性变化的关系，为选育高含量AsA黑穗醋栗新品种提供理论依据。

黑穗醋栗作为高AsA含量的小浆果，其AsA的合成积累规律也日益受到人们的关注。在果实中AsA的含量或其氧化还原态通常与再生代谢相关酶的活性相关。本研究中以AsA含量差异较大的3个黑穗醋栗品种‘亚德’、‘布劳德’和‘利桑佳’为试材，测定了3种AsA含量不同的黑穗醋栗品种中相关酶的活性，结果表明，随着坐果时间的增加，3个不同品种黑穗醋栗果实中AsA的含量呈现先上升后下降的趋势，果实AsA的迅速积累期主要在坐果第2～3周，而且均在坐果第3周时达到最大值，这与果实的膨大期相吻合，也可能与AsA参与果实初期细胞分裂有关，随后随着果实的膨大AsA含量逐渐下降。这与苹果、猕猴桃、小麦的AsA积累特点基本一致，在果实生长发育初期AsA含量迅速上升，在果实发育中后期含量逐渐下降。

越桔、草莓、甜樱桃、猕猴桃、苹果、枸杞等的研究表明，AsA含量与DHAR和MDHAR活性密切相关。将MDHAR在番茄和烟草叶绿体中超表达后，发现它们的AsA含量分别上升1.2倍和2.2倍。而将小麦DHAR分别在烟草和玉米中过量表达后，结果发现DHAR活性增加了32倍多，烟草和玉米叶片的AsA含量增加了4倍，不光对AsA含量的有所影响，而且GSH含量也增加了2.6倍，且GSH/GSSG 的比率也增加，说明由DHAR过量表达引起的AsA含量提高的同时，GSH的合成也伴随着增加。这在马铃薯和拟南芥中同样得到了证实。这些结果说明，AsA再生能力在维持AsA含量中起着重要作用，且可能在特定条件和发育阶段对AsA水平起到主要的调控作用。在本实验中研究结果表明：与AsA-GSH循环再生途径相关的DHAR、MDHAR和GR酶活性变化是先增加后减少，但DHAR和MDHAR活性最大值出现在第4周，与AsA含量相比延后一周。推测这可能与果实的快速膨胀有关，这样能够保证果实膨胀后，AsA含量下降的不那么快。而APX活性变化与之相反，在第1～3周迅速下降，在第3周达到最小值，随后逐渐趋于平稳。APX是植物体内利用AsA作电子供体清除H2O2的关键酶，APX将AsA转化为MDHA，APX活性的降低有助于确保AsA含量的积累与稳定。这些研究结果不仅证实了AsA含量与DHAR和MDHAR活性密切相关，而且有力地支持了AsA-GSH循环在几种园艺作物中的AsA合成和积累中起着至关重要的作用。我们的试验结果也表明在黑穗醋栗果实和叶片中AsA-GSH循环对AsA的生物合成和积累起着重要作用。

GSH/GSSG值越高意味着GSH量越高，同时表明有越多的DHA可通过DHAR和GSH的作用转化为AsA。本研究结果表明，黑穗醋栗果实中的GSH/GSSG比值总是大于叶片，而且黑穗醋栗叶片中GSH/GSSG比值与AsA含量呈正相关。对枝条进行摘叶处理后，叶片中无论是GSH的含量还是GSH/GSSG的比值都有下降的趋势，说明摘叶处理对叶片中抗坏血酸的ASA-GSH循环有一定影响，而对果实中无太大影响。摘叶处理后，对照组果实中GR活性略大于处理组，但无显著性差异，这说明摘叶处理对其果实中GR活性影响不大。摘叶处理后第3周，叶片中GR活性迅速升高，与同期的对照组相比差异显著，而其他坐果时期并无显著性差异。这与在番茄中的研究结论相一致。这表明，GSH及GR参与AsA-GSH循环来完成黑穗醋栗中AsA的积累。

目前研究发现在植物的细胞质、叶绿体和胞外环境中都含有AsA，且AsA浓度达到毫克级，AsA在细胞内和细胞间都是可以自由移动的，说明在植物中存在高效的AsA跨膜和长距离转运系统，因此AsA在植株内的移动也是影响AsA含量的一个重要因素，特别是器官或组织间的长距离运输。但由于AsA长距离运输的提出，使植物库器官中 AsA 的形成机制变得复杂化。摘叶处理对果实中AsA含量有一定的影响，因此我们猜测AsA在叶片和果实中存在长距离运输的关系，其AsA含量主要取决于果实的生长环境，而源-库运输对果实AsA含量的影响并不大。此外拟南芥和紫花苜蓿的研究表明，AsA的合成主要在源叶中，可经韧皮部向芽、花等库组织进行长距离运输。这在杨树和马铃薯中也得到了相同的结果，这进一步证实了AsA存在长距离的运输。在我们之前的研究中，通过摘果处理来测试黑穗醋栗中AsA是否存在长距离运输，我们发现摘果处理前黑穗醋栗叶片中的AsA含量比果实高得多，然而，摘果处理后，叶片中的AsA含量立即下降，果实中AsA水平高于叶片。因此，这种现象可能是黑穗醋栗叶片和果实之间AsA长距离运输的间接证据，与本实验摘叶处理试验结果相吻合。

但是Hancock曾通过多种试验证明黑穗醋栗叶片中合成的AsA对果实中AsA的积累无影响，认为主要是通过L-半乳糖途径来合成AsA，还发现树莓中的AsA主要取决于自身的合成能力，几乎不能检测到AsA运输的存在，但是叶片对果实的糖供应能力可能对树莓AsA的合成具有一定的调控能力。对源叶和果实的遮阴实验表明，单独对番茄果实遮阴会导致果实AsA含量的显著下降，说明光照在番茄成熟果实AsA原位合成中起重要作用。同时有研究指出，AsA从源叶到果实的运输取决于果实的生长阶段，如摘除黑穗醋栗的花朵或番茄果实并不影响它们果实中AsA的积累。还有研究表明，刺梨在果实发育后期才开始积累AsA，直至果实成熟，且接近成熟时AsA积累速率最高，这表明果实内AsA积累可能受到不同生长发育阶段的调控。因此不同作物的AsA的积累可能有所不同，黑穗醋栗的AsA的长距离运输还需要进一步验证。

摘叶处理会改变果实表面光照、温度等外部环境条件的变化，进而影响黑穗醋栗果实中AsA的最终含量。对黑穗醋栗进行摘叶处理后，叶片的相对减少对AsA含量以及相关酶的活性有一定的影响，且该影响在果实和叶片之间存在差异。通过实验数据分析表明，摘叶处理后，黑穗醋栗叶片中AsA含量以及其他酶活性均有所增加，而果实中AsA含量、APX活性以及MDHAR活性有所降低，GSH含量、DHAR和GR活性无变化。虽然本实验对黑穗醋栗果实和叶片AsA含量的关系进行了初步推断，但最直接的证据可用同位素示踪法来验证，这也是未来我们的研究重点之一。另外黑穗醋栗AsA的主要合成途径是L-半乳糖途径，其两种关键酶L-半乳糖脱氢酶和L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶是如何在摘果或摘叶中调控叶片和果实中AsA的含量的还需要继续研究。