流式细胞仪藻类在线监测系统—架构与应用

王 玉，李 涛，徐 枫

（太湖流域水文水资源监测中心，江苏 无锡 214024）

藻类在自然水域中的种类分布极为广泛，它们对自身生存环境水质的变化较为敏感。在水环境质量监测研究中藻类监测日益受到人们的重视。藻类群落的监测内容主要是种类、数量、生物量等，是水体富营养化程度的重要指示指标。传统的监测方法为人工鉴定，利用光学显微镜直接观测藻类以获得所需数据，需要复杂的人工操作和专业的生物学分类知识，费时费力，不能及时反映水体污染状况，且不能进行原位、实时的监测，难以满足种群动力学观测量大、连续的要求[1]，在实际应用中具有一定的局限性。在指导生产和实际应用中，需要方便、快捷、直观的藻类在线监测技术。比较分析现有的藻类在线监测技术，并着重介绍自主构建的一种适用于浅水湖泊的流式细胞仪藻类在线监测系统，以期为浅水湖泊的藻类在线监测提供新方法。

1 藻类在线监测技术

近 20 a 来，荧光技术在藻类监测方面取得很大发展，实现了建立在叶绿素荧光原理基础上的藻类在线监测。目前已有的藻类在线监测技术主要分为以下 3 类：1）主要监测水体中的叶绿素含量，但不具备藻类分类功能，仅适用于监测水体中叶绿索的变化趋势[2]。2）利用不同的激发光源，根据特征光谱可将水体中的藻类区分四大类藻类（蓝藻、绿藻、硅藻、隐藻），并对藻细胞数量或生物量进行定量，在监测叶绿素、藻类数量变化和种群更迭上取得了直观的效果，适用于水质监测和预警工作[3]。但不同水体需要确立不同参数，在使用过程中结果易受到不同藻类荧光遮挡、泥沙和光照等因素的影响，在使用过程中应尽量调整参数至精准，增大检测频次减少光照对检测结果的影响[4]。3）流式细胞仪藻类在线监测，流式细胞技术是指对处在快速直线流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术[5]。可对水体中的藻类进行颗粒计数，依据不同类群所含特征色素及粒径区别，可进一步细分到种的级别，其应用在小粒径的链状藻占优势的海域，可以有效地避免分粒级过滤中的误差，从而准确监测藻类群落的粒级结构[6]。

2 流式细胞仪藻类在线监测系统架构

已有的水下在线浮游植物流式细胞仪（CytoSub）主要适用于深水湖泊或海洋，无法应用于太湖这类浅水湖泊。为了实现太湖的藻类在线监测，自主设计构建了基于便携式浮游植物流式细胞仪（CytoSense）的藻类在线监测系统。

2.1 构建思路

荷兰的 CytoSense 流式细胞仪工作原理：样品中的悬浮颗粒在鞘液的包被下呈单行排列，依次流经检测区域。在检测区，激光束照射在通过的颗粒上，一方面由于颗粒大小和内部结构等的差异向四周发射不同角度的散射光；另一方面颗粒吸收光能激发不同波长或颜色的荧光，而这些散射光和荧光都能被不同的检测器检测产生信号。发射荧光经一系列双色反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号，这些荧光信号的强弱代表了细胞颗粒内含有相关荧光物质的浓度。通过这些表征颗粒不同性质的光信号就可将不同类型的颗粒区分开来，如图1 所示。

图1 CytoSense 分析原理图

经过多年的发展，该流式细胞仪已具备在线监测功能，可通过其控制软件 CytoUSB 设置检测时间，定时开展检测。但由于其不具备在野外直接工作的能力，需要为其提供站房、供电、空调等条件，且其内部只有一个较小的蠕动泵用于进样，进样管长度有限，不具备直接抽取自然水样进行检测的能力，需要为其提供水样。基于以上 2 点，选择将该设备放置于已有站房中，设计构建取排水和清洗管路、电子控制等系统及取样水池硬件，并编制控制整个系统有序运行的软件。在整个系统的设计中，主要有以下 3 个创新点：

1）该系统在采样过程中使用蠕动泵代替简单的自吸泵，尽可能地减少采样过程中对藻类的伤害，监测结果更准确；而传统的藻类监测技术则需利用固定剂固定藻类，对藻细胞有所损伤，且在运输及保存过程中的颠簸也会对藻类细胞造成影响。

2）针对太湖藻类以微囊藻为主要优势种的特点，为了获得较为准确的藻类细胞数量，加入了水样前处理，通过超声破碎的物理方法将藻类大团体打散为小团体甚至单体，同时通过磁力搅拌器对水样进行搅拌，避免藻类上浮影响检测的准确性。

3）针对水体中不同深度的藻类分布不同的情况，设计了 3 个取水管路，能够采集监测水体垂直方向不同水深处的藻类样本，以获取水体垂直方向上不同位置处的藻类数量、种群结构的特征及变化规律。

2.2 系统架构

该系统主要由 5 个部分组成，取排水、前处理、检测、清洗和控制等部分，如图2 所示。其中取排水部分包括取水管、排水管、溢流管、水池、蠕动泵，前处理部分包括超声细胞破碎仪、磁力搅拌器、搅拌转子，检测部分包括浮游植物流式细胞仪、废液桶，清洗部分包括冷水管、热水管、热水器，控制部分包括主控电脑、电子控制箱、控制缆线、水位传感器、电磁阀、相关控制软件等。系统整体运行环境需有站房，提供水、电、信息传输等条件。

图2 流式细胞仪藻类在线监测系统示意图

取水管伸入水体的一端分叉形成 3 支进水管，分别伸入水体的不同深度，以获得水体垂直方向上的藻类组成情况；取水管的另外一端连接有水池，中间通过蠕动泵将水样抽取到水池中，通过对 3 支进水管上的电磁阀的开合控制，可分别抽取不同深度的水样进行单独检测，也可同时抽取不同深度的水样进行混合检测。水池的上部侧面分别连接进水管、溢流管和清洗管，底部连接排水管，并放置有搅拌转子和磁力搅拌器，超声细胞破碎仪的变幅杆、水位传感器和流式细胞仪的进样管分别由水池顶部伸入内部。由于此系统为降低对自然水体环境的影响，直接抽取自然水体进行检测，未使用其他化学试剂。为防止管路和水池中滋生藻类而影响检测结果，需对系统及时进行清洗。每次检测流程结束后，通过控制相应管路上的电磁阀的开合，先用热水对整个系统的管路及水池进行清洗，再用冷水清洗，最大程度地杀死并冲走残留的藻类。清洗系统所需水量较大，选择直接排入自然环境，系统的各个设备、电子元件通过缆线与电子控制箱连接，进而与主控电脑相连，在主控电脑相应软件的控制下，协同配合，完成藻类的在线监测过程。

2.3 运行与维护

到达预先设定好的检测时间后，控制软件根据检测流程，通过电子控制箱与各个电子元件之间保持联系，发送指令、接收反馈信号，以完成对整个检测流程的控制。蠕动泵抽取指定水层的水样，并送入水池，当水池中的水达到指定深度时，停止采样，对水样进行超声处理后，流式细胞仪开始检测工作，检测工作完成后将水池中的水排向自然水体。当分别完成 3 层水体的检测后，系统启动自清洗程序，完成整个检测流程。也可根据需要同时抽取 3 层的水体进行检测，或只检测某一层的水体，灵活设定。完成检测后，解析软件可对检测文件自动进行解析，获得相应的检测结果。在建立好通讯条件的前提下，藻类在线监测的数据可及时传回实验室，且使用者可以通过远程控制，实时查看系统运行情况，修改检测参数等。

该系统采用全仪器操作的模式，效率更高，且与远程控制系统相结合，方便决策者根据需要对监测区域的藻类数目及种群结构等作出实时原位的检测判断，并对藻类变化趋势作出预测，通过终端电脑既能够做出检测决定并可以设定相应参数，实现藻类检测的自动化操作，方便快捷。

系统日常运行中主要需要清洗维护，需根据水体浑浊程度及使用频率确定维护频率，定期更换内部管路、补充仪器内部使用的生物抑制剂、清洗或更换滤器、清洗水池等，维护过程简单，但耗时。

3 应用实例

蓝藻水华是目前全世界共同面临的重大环境问题之一，就太湖而言，蓝藻水华的发生已经成为常态，主要发生在夏秋季节。如果水华在水源地取水口附近大量集聚就有可能引起水源地的水质恶化，危及供水安全[7]。太湖贡湖是流域的重要水源地，实时监控贡湖水源地的藻类数量与变化情况，及时预警蓝藻水华，是太湖重要水源地管理与保护的迫切需求。

选取太湖中不同藻密度的水样进行检测，该系统工作正常，显示该流式细胞仪藻类在线监测系统可适应高浓度藻类的水体。目前，该系统已成功应用于太湖贡湖水源地。太湖平均水深 2 m，此系统分别在水下 0.5，1.0 和 1.5 m 处设置取水管，监测频率为每天 4～6 次，每次均对这 3 个深度的水体进行取样检测。由于太湖水体较浑浊，且藻类在线监测频次较高，易在流式细胞仪内部管路形成结晶，需每个月进行 1 次系统清洗维护。

通过实验室人工镜检对比，借助分类软件，可建立适用于所监测水体的 CytoSense 浮游植物流式细胞仪的藻类数据库，实时提供所需的藻类信息。在水体中起到决定作用的是藻类优势种，只要能够对其进行分类和定量，就能够实时掌握水体中藻类的总体变化趋势和状态。微囊藻在太湖浮游藻类中占绝对优势，是太湖蓝藻水华的主要构成种。该系统已实现对太湖贡湖水源地的微囊藻自动在线监测，可实时提供藻类和微囊藻颗粒及细胞等密度。

选取贡湖水源地 2017 年 6 月 15 日—12 月 15 日每日上午 8 时水下 0.5 m 的流式细胞仪在线监测结果，分析微囊藻细胞密度变化情况，如图3 所示。贡湖水源地的微囊藻细胞密度在 6 月 20 日—7 月 20 日明显高于其他时期，微囊藻细胞密度在 6 月 30 日和7 月 7 日达到峰值之后逐渐降低至 5×104个/mL，8 月 15 日—9 月 10 日微囊藻细胞密度有所上升，9 月15 日之后微囊藻细胞密度呈现下降趋势，10 月中旬至 12 月中旬微囊藻细胞密度基本维持在 4×104个/mL。

4 结语

图3 微囊藻细胞密度变化

浮游植物流式细胞仪技术的不断发展，使得该技术成为最有可能实现有害藻类早期预警的技术方法。研究的流式细胞仪藻类在线监测系统针对太湖蓝藻水华，实现了对优势种微囊藻的实时、高频、分层监测，为贡湖水源地的蓝藻水华预警提供了有力的支撑，且系统维护相对简单，具有较高的实用性。但是，流式细胞术主要是根据细胞大小及色素差异对一些特定类群藻类进行识别，对于室内培养的纯种藻分类效果较好，而野外样品要复杂的多，且藻的差异较大。此系统应用于其他浅水湖泊，需要使用者根据实际情况建立适用于该水体的藻类信息数据库，方可实现部分藻类的自动分类。

太湖的贡湖湖区是典型的浅水湖湾，该系统在贡湖的成功应用，说明其适用于浅水湖泊的藻类在线监测，有一定的推广意义。流式细胞仪功能强大，优势明显，在实际应用中应逐步探索形成标准的监测方法，以便推广应用。