应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析饲粮添加乳双歧杆菌对蛋雏鸡盲肠微生物的影响

张李荣，杨海明，*，龚道清，肖 霞，唐徐华，王志跃，2

(1.扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009； 2.扬州大学 农业科技发展研究院，江苏 扬州 225009)

乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)属于革兰氏阳性厌氧菌，作为一种微生物饲料添加剂，具有促进动物生长、保护黏膜屏障、调节肠道菌群和加强免疫等功能[1-2]。其发挥益生效用是多种机制共同作用的结果，包括加强营养吸收、竞争黏附位点、释放抑菌物质、激活宿主免疫因子等。胡学智[3]认为，一些难消化低聚糖可促进双歧杆菌的增殖，这类未消化的低聚糖到达后肠后，可被双歧杆菌发酵利用，产生的乳酸、H2O2、CO2等化学物质对腐败菌有抑制作用，而酸性环境也更利于钙、镁、锌等矿物质的消化吸收。Merrifield等[4]用乳双歧杆菌NCC2818饲喂断奶仔猪后发现，饲喂组仔猪代谢表型具有差异性并持续变化，同时影响微生物代谢。宋晓玲等[5]将双歧杆菌细胞壁肽聚糖制成悬浮液，注射日本对虾后发现显著提高对虾血清内的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PO)活性和溶菌酶(lysozyme，LSZ)活性。范金波等[6]研究发现，双歧杆菌能够增强迟发型变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)，提高小鼠巨噬细胞的吞噬活性和自然杀伤细胞活性，血清溶血素水平和脾淋巴细胞增殖率均有提高。所以，在提倡畜牧生产逐渐减少直至禁止使用抗生素的大环境下，乳双歧杆菌作为一种潜在替代品，具有重要研究价值。

动物肠道寄居着大量微生物，被称为机体的“第二基因组”，这些微生物与宿主相互作用，共同构成了稳定协调的肠道系统。同时，肠道微生物可受动物个体、年龄、饮食结构、环境应激等多种因素的影响而变化，这种变化会对宿主肠道形态、功能和免疫等方面产生重要作用[7-10]。据研究报道，鸡盲肠内容物微生物大约为1011个·g-1，无论是从微生物种类还是数量上看，都是其他肠道所无法比拟的[11]。盲肠微生态系统受到了广泛关注，但传统的微生物检测方法，如平板培养、凝胶电泳PCR、荧光定量PCR或其他的间接测定方法存在一定的局限性，而二代测序技术一定程度上弥补了缺陷，为相对全面而准确地检测微生物提供了可能[12-13]。本试验运用高通量测序技术，测定雏鸡盲肠微生物，产生覆盖广、深度深的测序数据，并通过微生物丰度和多样性比较，判定样本间微生物组成差异，更深入地挖掘和了解盲肠微生物信息，为乳双歧杆菌在动物生产上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与动物

乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)冻干粉购自山东中科嘉亿生物工程有限公司，经实测乳双歧杆菌活菌数为1.5×1010cfu·g-1。罗曼褐蛋公雏由金湖县永祥种鸡有限公司提供。

1.2 饲养管理

试验在扬州大学试验动物房进行。按常规饲养程序进行饲养管理，三层阶梯式笼养，自由采食和饮水。第1周控温在33 ℃，后每周降低3 ℃，直至室温21 ℃左右。1 日龄时进行马立克氏病免疫，7、28 日龄时用新支二联苗进行新城疫免疫，14 日龄时进行法氏囊病免疫。

1.3 试验设计

选取1日龄健康、体质量相近的罗曼褐蛋公雏216只，随机分成2个组，每组6个重复，每个重复18只鸡。对照组饲喂粉状基础饲粮(C组)，无抗生素；试验组饲喂基础饲粮另添加乳双歧杆菌冻干粉(T组，添加量为1×107cfu·g-1)，人工投料，试验持续42 d。试验结束后，每处理组随机选取6只鸡，再从中选出体质量相近且状态良好的3只，收集盲肠食糜样并进行高通量测序。

1.4 试验饲粮

试验饲粮参照NRC(1994)营养需要配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。

1.5 盲肠食糜样收集与处理

试验结束后，将6只鸡禁食12 h后处死。在无菌条件下打开腹腔，结扎盲肠两端，剪下后转移至超净工作台，用无菌剪刀剪开盲肠肠壁，采集食糜置于冻存管中，迅速投入液氮后转至-70 ℃保存，备用。后将样品送往上海生工生物工程股份有限公司进行16S rDNA高通量测序。

1.6 DNA提取和扩增

食糜样品采用OMEGA公司的E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取样品的总基因组DNA，具体步骤参照说明书，并用琼脂糖凝胶电泳进行定性检测和测定浓度。以提取的DNA为模板，对16S rDNA V3-V4可变区进行PCR扩增，融合了Miseq测序平台的通用引物序列：341F(5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTAC-HVGGGTATCTAATCC-3′)。扩增体系30 μL：2×TaqMaster Mix 15 μL，Bar-PCR Primer F(10 μmol·L-1) 1 μL，Primer R (10 μmol·L-1) 1 μL，模板DNA 20 ng。扩增条件：94 ℃ 3 min，5个循环(94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s)，20个循环(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)，最后72 ℃延伸5 min。将扩增产物进行纯化回收后上机测序，最终上机测序浓度为20 pmol·L-1。

1.7 数据处理与分析

用CASAVA对原始图像数据文件进行碱基识别，分析转化为原始测序序列(raw data)。再通过去杂拼接、质量控制、筛选并去除嵌合体序列步骤后，使用Usearch软件将干净序列按97%相似水平聚类成操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。计算丰度指数和多样性指数，并进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，利用R软件作图；采用 SPSS 19.0进行方差分析(ANOVA)。

2 结果和分析

2.1 乳双歧杆菌对蛋雏鸡生产性能的影响

由表2可知，饲粮中添加乳双歧杆菌可显著提高雏鸡体质量、平均日增重及平均日采食量(P<0.05)，但对料重比无明显影响。

2.2 测序结果

对6个盲肠食糜样品进行测序，结果显示(表3)，对照组和乳双歧杆菌组分别获得平均原始序列为65 671和68 191条，其中优质序列数分别为54 446和58 468条，平均序列长度分别为451.63和457.58 bp，在97%相似水平上分别平均归类成751和809个操作分类单元。利用R软件作稀释性曲线(rarefaction curve)(图1)，由图1可知，随着测序深度的增加，曲线趋于平坦，说明测序具有合理性，各样本能够真实反映微生物组成情况。

表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table1Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

原料 Ingredients含量Content/%营养水平Nutrient levels含量Content2)玉米 Corn66.5代谢能 Metabolism energy/(MJ·kg-1)11.97豆粕 Soybean meal27.0粗蛋白质 Crude protein/%19.06鱼粉 Fish meal2.0蛋氨酸 Met/%0.47磷酸氢钙 CaHPO41.7赖氨酸 Lys/%0.89石粉 Limestone1.1钙 Ca/%0.98蛋氨酸 DL-methionine0.2总磷 Total phosphor/%0.71赖氨酸 L-Lysine0.2食盐 Salt0.3预混料 Premix1)1.0合计 Total100.0

1) 预混料为每千克饲粮提供VA5 000 IU，VD31 500 IU，VE10 IU，VK38 mg，VB18 mg，VB23 mg，VB615 mg，VB129 μg，生物素0.2 mg，叶酸0.5 mg，泛酸钙45 mg，烟酰胺50 mg，Fe 80 mg，Zn 40 mg，Mn 60 mg，I 0.35 mg，Cu 8 mg，Se 0.15 mg。2) 以上均为计算值。

1) The premix provided the following for per kg of diets: VA5 000 IU，VD31 500 IU，VE10 IU，VK38 mg，VB18 mg，VB23 mg，VB615 mg，VB129 μg，Biotin 0.2 mg，Folic acid 0.5 mg，Calcium pantothenate 45 mg，Niactinamide 50 mg，Fe (as ferrous sulfate) 80 mg，Zn (as zinc sulfate) 40 mg，Mn (as manganese sulfate) 60 mg，I (as potassium iodide) 0.35 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg. 2) These are all calculated values.

表2乳双歧杆菌对雏鸡生产性能的影响

Table2Effects ofB.lactison production performance of layer chicks

项目Items对照组Control group乳双歧杆菌组 B. lactis groupP 值 P-value体质量Weight/g536.17±26.77 b569.69±7.87 a0.015平均日增重 Average daily gain/g11.91±0.64 b12.72±0.19 a0.014平均日采食 Average daily intake/g27.47±1.11 b29.24±1.09 a0.019料重比 Feed/gain ratio2.31±0.052.30±0.060.793

同行数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)，没有相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

In the same row，values with different lowercase letter mean significant difference (P<0.05)，with different capital letter mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表3盲肠食糜测序结果

Table3Sequencing results of cecal chyme

项目Item对照组Control group乳双歧杆菌组 B. lactis group原始序列数Raw sequence number6567168191优质序列数 High quality sequence number5444658468平均长度Mean length/bp452458操作分类单元OTU751809

2.3 盲肠微生物丰度差异

为探究乳双歧杆菌对雏鸡盲肠微生物丰度及多样性的影响，在门、属2个分类水平上对不同OTU进行分类比较。

2.3.1 门水平

由表4和图2可知，42 d时，两组盲肠菌群在门水平上均以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、互养菌门(Synergistetes)为主，其中对照组脱铁杆菌门(Deferribacteres)含量为0，乳双歧杆菌组有4.22%菌门未被分类。两组均以Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)为优势菌门，分别占比为61.77%、37.00%、1.03%(累计占99.8%)和39.93%、53.91%、1.13%(累计占95%)。两组间拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)含量存在显著差异(P<0.05)，与对照组相比，乳双歧杆菌组拟杆菌门(Bacteroidetes)显著降低35.3%，厚壁菌门(Firmicutes)显著提高45.7%。试验组Firmicutes∶Bacteroides (F∶B)比值高于对照组。

C1、C2、C3为对照组；T1、T2、T3为乳双歧杆菌组。C1, C2, C3 are the samples of control group; T1, T2, T3 are the samples of B. lactis group.图1 稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve

C组为对照组(平均值)；T组为乳双歧杆菌组(平均值)。Group C is control group (mean); Group T is B. lactis group (mean).图2 门水平菌群相对丰度Fig.2 Abundance of cecal microorganism in phylum

表4盲肠菌群门水平丰度

Table 4 Abundance of cecal microorganism in phylum %

2.3.2 属水平

由表5和图3可知：在属水平上主要以Alistipes、Barnesiella、Faecalibacterium、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus2)等属种为主。与对照组相比，乳双歧杆菌组Barnesiella丰度显著提高(P<0.05)，Clostridiumsensustricto含量为0，Butyricicoccus、Romboutsia、乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度显著提高(P<0.05)，梭菌ⅩⅣa类群(ClostridiumⅩⅣa)丰度有降低的趋势(P=0.063)，未分类属丰度有提高趋势(P=0.057)。另外，埃希氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)丰度极显著降低75%，芽孢杆菌属(Bacillus)丰度含量相同，双歧杆菌属(Bifidobacterium)含量分别为0.01%和0.02%，但无统计学差异(P>0.05)。

2.4 多样性分析

本文选用Chao1、Ace、Shannon、Simpson和Coverage指数来评测样本中微生物丰度和多样性。Ace和Chao1指数用来估计物种丰度；Shannon和Simpson指数用来估计微生物多样性，多衡量群落异质性，两者值越大，则说明群落多样性越高。Coverage指数表示各样品文库的覆盖率，实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。

由表6可知：两组覆盖率均为0.99，接近于1，说明两组数据结果能反映真实情况。从Chao1和Ace指数上看，乳双歧杆菌组菌群丰度均大于对照组，分别高出10.1%和12.1%。同时，与对照组相比，乳双歧杆菌组Shannon和Simpson指数均显著大于对照组(P<0.05)。

表5盲肠菌群属水平丰度

Table 5 Abundance of cecal microorganism in genus %

本表列出了属水平丰度占比相对较高菌属、部分有益菌属和有害菌属。

This table listed the relatively high abundance bacteria，and some beneficial and harmful bacteria in genus.

表6盲肠微生物Alpha多样性分析

Table6Alpha diversity analysis of cecum microorganism

项目Item对照组 Control group乳双歧杆菌组 B.lactis groupP 值 P-valueChao1指数 Chao1 index960.13±109.011057.05±232.080.548Ace指数 Ace index991.26±94.531110.91±280.90.523Shannon指数 Shannon index3.63±0.18 b4.04±0.06 a0.023Simpson指数 Simpson index0.92±0.02 b0.95±0.01 a0.049覆盖率 Coverage0.996±0.0010.996±0.0010.447

综上得知，添加乳双歧杆菌后，雏鸡盲肠微生物不仅丰度增加，而且菌群多样性也显著提高，微生物种类更多，均匀性更高。

本文对不同样本OTU(基于门水平)进行主成分分析，PCA分析将降低数据维度，以挖掘复杂数据背后的简单信息。由图4可知：第一主成分方差贡献率为61.0%，第二主成分方差贡献率为27.5%，累计为88.5%，两主成分选择具有合理性。对照组和乳双歧杆菌组的样本点分布区域不同，而各自重复点相对能够靠拢在一起，说明处理间群落构成存在差异性。

图3 盲肠微生物heatmap分析图Fig.3 Heatmap analysis of cecal microorganism

图4 基于门水平的主成分分析Fig.4 PCA analysis by phylum

3 讨论

动物体肠道是肠道物理结构、功能、内容物和微生物相互作用的一个动态平衡的生态系统。乳双歧杆菌作为一种益生菌，通过多种机制影响肠道微生态系统。双歧杆菌细胞上的磷酸能与肠黏膜上皮细胞特异性结合，从而占据肠黏膜表面，阻止各种致病菌的定殖[14]。刘国荣等[15]研究发现，双歧杆菌与致病菌对细胞的作用具有本质上的区别，双歧杆菌的黏附能减缓致病菌对细胞所造成的损害。同时，双歧杆菌能够发酵碳水化合物，产生大量乙酸、乳酸等有机酸，降低肠道pH或Eh值，以抑制病原菌的产生。另外，双歧杆菌的表面成分也能够激活肠道模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，从而诱导机体产生相关免疫因子，抑制病原菌并加强免疫耐受[16-17]。这些机制共同创造了一个优良的肠道环境以达到改善宿主健康的目的。

研究表明，鸡盲肠微生物主要由Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)及Proteobacteria(变形菌门)3种门构成，这与本研究结果一致[18-20]。Firmicutes(厚壁菌门)与Bacteroidetes(拟杆菌门)的比值(F/B)与脂肪沉积相关性强，肥胖个体的Firmicutes含量可能更高，而Bacteroidetes含量相对更低。朱宏斌等[21]用高脂饲料喂养C57BL/6J小鼠后发现，与对照组相比，肥胖组厚壁菌门含量显著升高，拟杆菌门含量显著下降。Ismail等[22]比较了正常和肥胖人群的肠道微生物差异，发现肥胖人群Firmicutes与Bacteroidetes比例显著增加。这可能与Firmicutes促进脂肪沉积能力比Bacteroidetes强有关，高F/B值的肠道拥有更多的编码裂解多糖起始酶的基因及相关糖类水解酶，更利于机体对养分和能量的吸收储存。本试验结果显示，乳双歧杆菌组拟杆菌门含量显著下降，而厚壁菌门含量显著上升，结合本试验雏鸡生长性能数据，推测乳双歧杆菌通过提高F/B比例改善脂肪沉积情况，以实现促生长功效。

彭骞骞[7]在研究温度对肉鸡盲肠菌群多样性的影响时发现，适温和偏热环境下肉鸡盲肠内的共性菌群是Alistipestimonensis和Barnesiellaviscericola。Wilkinson等[23]研究发现，火鸡盲肠主要存在Alistipes、Anaerovorax、Bacteroides、Barnesiella等属，且含量显著高于其他肠道。本试验研究发现，在属水平上，主要存在Alistipes、Barnesiella、Faecalibacterium、Bacteroides等属，这与上述研究结果相似。Alistipes属革兰氏阴性厌氧杆菌，具有抗胆汁性，能产色素，并耐万古霉素、卡那霉素、多粘菌素，可降解多种寡糖和单糖，产生短链脂肪酸，细菌表型似脆弱类杆菌，条件致病[24]。本试验中两组Alistipes属含量无显著差异。Barnesiella属严格厌氧革兰氏阴性菌，不产色素，无芽孢，无鞭毛，可降解寡糖并产乙酸、琥珀酸等有机酸[25]。赵滢[26]报道，Barnesiella是肠道常见优势菌群，当肠道菌群平衡被破坏后，Barnesiella大量减少且不易恢复。同时，Barnesiella对抗生素具有敏感性，Ubeda等[27]发现，Barnesiella对耐万古霉素肠球菌引起的感染有治疗作用。本试验结果显示，乳双歧杆菌显著提高Barnesiella含量。Faecalibacterium属厚壁菌门，无运动性，能产丁酸、甲酸和乳酸[28]。F.prausnitzii属于Faecalibacterium，在机体免疫防护过程中扮演着重要角色，被证实具有抗炎作用，可通过调节白介素IL-17在内的炎症因子的分泌来预防三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎的发生[29]。本试验中乳双歧杆菌组Faecalibacterium含量上升。Bacteroides为革兰氏阴性专性厌氧小杆菌，正常情况下参与宿主代谢，但在肠道中积聚一定量后对宿主有害，本试验乳双歧杆菌组Bacteroides含量下降34.5%，但差异不显著。同时，本试验中Butyricicoccus和Romboutsia含量均显著提高，有报道显示两种菌属均表现出益生性，Romboutsia菌属与益生菌引起的肠道变化有关，并可减轻大鼠的急性胰腺炎症状[30]。Eeckhaut等[31]研究发现，炎症性肠病个体大便中Butyricicoccus含量较低，而口服B.pullicaecorum后，大鼠肠道肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-12水平降低，对肠道具有明显保护作用。另外，肠道存在一定量梭菌，本试验中乳双歧杆菌组Clostridiumsensustricto(狭义梭菌属)、ClostridiumⅩⅣa和ClostridiumⅣ含量不同程度下降。Clostridiumsensustricto属于严格梭菌属，许多种可产生外毒素，具有潜在致病性，如产气荚膜梭菌和破伤风梭菌等。ClostridiumⅩⅣa类群和ClostridiumⅣ类群属于肠道共生菌，大量产酸。

研究显示，两梭菌类群含量变化与炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)感染关系密切，Kabeerdoss等[32]研究发现，IBD可能导致肠道ClostridiumⅣ含量和多样性下降。Honda 等[33]研究也表明，两类群含量上调可诱导T细胞的分化增殖，影响肠道Foxp3+CD4+Treg细胞的数量和功能，在肠道免疫应答过程中表现出积极效应，但对免疫细胞的强诱导性也可能会对机体产生负面影响。也有研究报道，梭状芽孢杆菌衍生抗原可能导致炎症性反应，结肠炎C3H/He JBir小鼠的血清中发现了一种CBir1的鞭毛蛋白，这种蛋白包含梭菌ⅩⅣa类群组中产气荚膜菌相关的鞭毛蛋白序列，可能引发结肠炎[34]。另外，Andersen 等[35]研究发现，ClostridiumⅣ菌可能受中链脂肪酸(MCFA)影响而抑制菌群混合发酵。后肠发酵对机体具有重要意义，糖类物质在后肠可被厌氧菌利用，并参与机体代谢及为肠上皮细胞提供能量[36-37]。Escherichia(埃希氏菌属)和Shigella(志贺氏菌属)具有高同源性，都具有不同血清型，是家禽生产中的一类重要的条件致病源，可引起机体局部或全身性感染[38]。本试验中乳双歧杆菌组Escherichia/Shigella菌属含量极显著(P<0.01)降低75%，推测乳双歧杆菌具有良好的抑菌作用。本试验也观察了多种有益菌的含量变化，发现乳杆菌属的含量显著上升，乳杆菌属具有促进肠道屏障发育、调节肠道免疫功能、降低腹泻风险等功能，有研究表明，双歧杆菌和乳杆菌在加强细胞免疫、体液免疫功能及NK细胞活性方面具有协同效应[39]。另外，两组均检测到了双歧杆菌属和芽孢杆菌属的存在，但含量极低，无显著性差异，这可能与个体、肠道、测序误差等因素有关，研究表明，即使同一个肠段之中不同的生物学重复都会出现不同程度的差别[40]。本试验中，乳双歧杆菌组未分类属含量具有上升趋势，推测乳双歧杆菌利于促进新的菌种产生。

本试验研究发现，在添加乳双歧杆菌后，盲肠微生物丰度增加，Shannon和Simpson指数显著上升，组间存在差异性。肠道菌群的平衡对宿主健康具有重要意义，机体在疾病或应激状态下，肠道菌群种类和数量都会下降[41-42]。这种情况下，机体对抗不良因素的能力会变弱，而丰富的菌群含量和种类可加强营养、免疫等多种机体恢复机制，通过调整饮食结构、改善生活环境或喂食药物等途径，可重新平衡肠道菌群，加强肠道耐受和免疫机能，以促进宿主健康。