市售农残速测仪对青菜中毒死蜱和三唑磷的检测评价

汪志威，沈玉姣,2，徐浩，周思齐，徐霞红，齐沛沛，王祥云，狄珊珊，王新全*

(1.省部共建国家重点实验室培育基地“浙江省植物有害生物防控重点实验室”农业农村部农药残留检测重点实验室 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江师范大学 行知学院，浙江 金华 321004)

果蔬中的农药残留问题一直受到群众的普遍关注，目前浙江省主要的生产基地、批发市场、农贸市场和超市等基层食品安全质监部门均已配备了农残速测仪，主要用于对蔬菜中有机磷与氨基甲酸酯农药的快速检测。它基于酶抑制率法的原理，具有前处理简单、检测时间短、不需昂贵的仪器、易于掌握等优点[1-3]。在上世纪80年农残速测仪得到了快速的发展，是目前研究最多，相对成熟，且在全省范围内使用最广泛的一种农药快速检测技术[4]。

毒死蜱和三唑磷是典型的有机磷农药，属于农残速测仪筛查范围[5]。过去在农业生产上也曾被推荐和广泛使用，但随着新型高效低毒农药的开发和农业安全生产要求的不断提高，自2016年12月31日起，依据农业部2 032号公告毒死蜱和三唑磷被禁止在蔬菜上使用。

目前针对农残速测仪的方法标准主要有GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测，NY/T 448—2001蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法，以及国家食品药品监督管理总局公布的食品快速检测方法《蔬菜中敌百虫、丙溴磷、灭多威、克百威、敌敌畏残留的快速检测》(KJ201710)等，然而上述标准和方法均未规定对新禁用农药毒死蜱和三唑磷的检测灵敏度范围。目前市场上使用的农残速测仪产品众多，涉及品牌包括博纳，复讯，瑞鑫，托普，天迈，藤蔓等13余个品牌，配套的酶试剂来源不同且具有明显的性能差异，因而评价市售速测仪产品对毒死蜱和三唑磷灵敏度，可以为更新和制定相关速测标准提供重要数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设备

毒死蜱和三唑磷标准品为购自农业农村部环境保护科研监测所(天津)的农药标准品，浓度为1 000 mg·L-1。青菜购自杭州东新农贸市场，经试剂盒检测结果为阴性，且抑制率均≤10%。市售的9种农残速测仪按照调研顺序排列，分别编为A、B、C、D、E、F、G、H、I，相应的酶试剂生产批次在2017年1—7月。青菜样品前处理QuEChERS方法净化材料包括乙酸钠，无水硫酸镁，石墨化炭黑，PSA和C18购自天津艾杰尔公司。气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)，型号为TRACE GC Ultra，由美国Thermo Electron Corpration公司生产。

1.2 方法

样品前处理。市售青菜样品剪成1 cm× 1 cm，称取2 g菜样于50 mL离心管中若干份，按需要添加不同浓度梯度的毒死蜱或三唑磷标准品溶液，静置30 min。加入10 mL缓冲液后，振荡提取5 min。

1.2.1 农残快速检测

缓冲溶液、显色剂、酶试剂和底物的配置。试剂的配置严格按照各厂家说明书执行，缓冲盐溶液的配置分为单包装直接溶解和2个包装混合溶解，酶试剂的配置分为5 mL和3.1 mL缓冲盐溶液2种类型。

样品(对照)制备。取上清液(对照为2.5 mL缓冲盐空白溶液)2.5 mL于10 mL离心管中，加入100 μL酶试剂，100 μL显色剂，混匀后在37 ℃水浴中静置10 min，然后加入100 μL底物后，转入比色皿上农残速测仪分析[6]。

1.2.2 色谱检测

分别将青菜和对应缓冲提取液分成2份样品，分别按照下述步骤前处理。

将青菜样品适当沥干后转入50 mL离心管中，加入10 mL乙腈溶液，匀浆1 min，加入4 g 无水硫酸钠和1 g氯化钠，涡旋1 min，7 000 r·min-1离心后取上清液5 mL，氮吹至少于1 mL，用乙腈定容至1 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混匀后7 000 r·min-1离心3 min，取上清液过0.22 μm有机膜后上机GC-FPD检测。

从提取液中取5 mL置入50 mL离心管，加入10 mL乙腈溶液，振荡1 min，加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠充分混合。离心3 min后取上清液2 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混匀后7 000 r·min-1离心3 min，取上清液过0.22 μm有机膜后上机GC-FPD检测。

1.3 处理设计

1.3.1 青菜样品中灵敏度试验

按照速测标准GB/T 5009.199—2003制备72份2 g空白青菜，分别添加6组标样，添加水平分别为0.1、0.5和5 mg·kg-1毒死蜱，0.1、0.5和5 mg·kg-1三唑磷，重复12组，其中3组平行样通过色谱检测，另外9组平行样品分别通过农残速测仪A、B、C、D、E、F、G、H、I及配套试剂盒上机检测。

1.3.2 缓冲盐提取液灵敏度试验

在灵敏度测试时使用各个品牌的农残速测试剂盒进行测试，同时为减少因检测仪器带来的系统误差，本试验使用农残速测仪A对各品牌试剂盒灵敏度进行评价。

首先，配置缓冲盐溶液2 L作为提取液，其次，使用提取液分别配置浓度梯度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、1、2、3、4和5 mg·L-1毒死蜱标准溶液，以及0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4和5 mg·L-1三唑磷标准溶液各100 mL。在提取液灵敏度测试时根据抑制率结果适当调整测试浓度，通常以2倍浓度调增或调减。

1.4 灵敏度

采用毒死蜱或三唑磷标准品，加入蔬菜样品中静置30 min，因抑制率与农药残留含量成正相关，且抑制率≥50%为阳性。测定某种农药灵敏度即检出限，用此农药标准品添加，使得抑制率为50%，即为此种农药检出限，在试验时添加后刚好测定抑制率为50%难以操作，因此添加使得抑制率接近且大于50%所对应的添加浓度即为灵敏度[7-8]。

2 结果与分析

基于酶抑制率法的农残速测仪，其原理是利用有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的活性，破坏神经的正常传导，是昆虫中毒致死这一毒理学原理[9-10]。将AChE与样品反应，如果试样中没有农药残留或者残留量极少，AChE的活性就不被抑制；反之，如果农药残留量比较高，AChE的活性就会被农药所抑制[11-12]，而抑制率与农药的浓度呈正相关。

2.1 毒死蜱和三唑磷基于色谱分析的添加回收率

为验证色谱检测方法能有效应用于缓冲盐溶液和青菜中毒死蜱和三唑磷的残留检测，本试验分别往2 g空白青菜和5 mL缓冲盐溶液A中添加毒死蜱和三唑磷混合标准溶液，农药添加水平分别为青菜0.05和0.25 mg·kg-1，缓冲盐溶液0.1和0.5 mg·L-1。结果如表1所示，青菜的添加回收率86.1%～108.0%，相对标准偏差0.1%～0.6%，缓冲盐溶液中农药的回收率80.1%～84.7%，相对标准偏差0.2%～0.9%。

表1 色谱分析方法对青菜和缓冲盐溶液中的 添加回收率

2.2 农残速测仪在添加毒死蜱和三唑磷青菜样品中的筛查结果

本试验在青菜样品中分别添加毒死蜱和三唑磷，共添加3个浓度水平0.1、0.5和5 mg·kg-1的毒死蜱。速测结果显示(表2)，在0.1和0.5 mg·kg-1添加水平时，9种速测仪对青菜样品中的毒死蜱和三唑磷均为阴性；在5 mg·kg-1毒死蜱添加水平下的青菜，A和B两种速测仪检出阳性，其余均为阴性；在5 mg·kg-1三唑磷的添加水平下，仅B、C和E筛查结果为阳性，且为弱阳性，其余均为阴性。

为验证青菜样品添加毒死蜱和三唑磷后的真实浓度，防止挥发等因素引起残留量的偏差，本试验对与速测仪检测对照的3组样品进行残留分析。结果如表2所示，色谱方法检测青菜中残留实测值分别为，毒死蜱在三档添加水平下分别为0.093、0.49和4.9 mg·kg-1，三唑磷分别为0.088、0.45和4.7 mg·kg-1，实测值与添加值结果基本一致。

表2 9种速测仪对青菜提取液中添加毒死蜱和三唑磷后的抑制结果

注：+表示抑制率≥50%，检测结果为阳性，-表示抑制率<50%，检测结果为阴性。

根据食品安全国家标准GB 2763—2016，按蔬菜种类划分青菜属于普通白菜，其毒死蜱的最大残留限量(MRL)为0.1 mg·kg-1；上述标准中未限定普通白菜中三唑磷的MRL，但规定结球甘蓝和节瓜中三唑磷的MRL为0.1 mg·kg-1；因而本试验中设定青菜中毒死蜱和三唑磷的MRL均为0.1 mg·kg-1。按9种速测仪检测结果显示，在0.1和0.5 mg·kg-1(5倍MRL)添加水平的毒死蜱和三唑磷，9种市售速测仪均无法检出阳性；即使在5 mg·kg-1的添加水平下，仅有A和B能检出毒死蜱的阳性，三唑磷的阳性略优于毒死蜱，有3种速测仪能检出阳性，但仍有6种速测仪无法检出这一添加浓度的三唑磷，说明农残速测仪在筛查蔬菜中毒死蜱和三唑磷的灵敏度有待提升。

2.3 农残速测仪对缓冲盐溶液中添加三唑磷和毒死蜱的灵敏度

9种市售农残速测仪对添加2种有机磷农药缓冲盐溶液的灵敏度检测时，分别以毒死蜱0.08和2.00 mg·L-1、三唑磷以0.30和0.50 mg·L-1的基准浓度调整测试浓度。如表3所示，按照灵敏度的定义可得9种速测仪对缓冲盐溶液中毒死蜱的灵敏度分别为0.06 mg·L-1(速测仪A)，0.06 mg·L-1(速测仪B)，>5 mg·L-1(速测仪C)，2.5 mg·L-1(速测仪D)，>5 mg·L-1(速测仪E)，>5 mg·L-1(速测仪F)，5 mg·L-1(速测仪G)，5 mg·L-1(速测仪H)，1.0 mg·L-1(速测仪I)。从9种速测仪对毒死蜱缓冲盐溶液测试结果看，A、B属于灵敏度高的第一梯队，在0.06 mg·L-1附近，I、D、G和H属于灵敏度第二梯队，在1～5 mg·L-1，C、E和F灵敏度较差，已经>5 mg·L-1。

各速测仪对缓冲盐溶液三唑磷的灵敏度，A为0.20 mg·L-1，B为0.15 mg·L-1，C为0.15 mg·L-1，D为0.20 mg·L-1，E为0.15 mg·L-1，F为0.20 mg·L-1，G为0.30 mg·L-1，H为0.30 mg·L-1，I为2.50 mg·L-1·L-1。如表4所示，从9种速测仪对三唑磷缓冲盐溶液测试结果看，A、B、C、D、E、F、G和H灵敏度较高，在0.15～0.30 mg·L-1，I灵敏度较差在2.5 mg·L-1左右。

表3 市售农残速测试剂盒对毒死蜱不同缓冲盐溶液的抑制率结果

表4 市售农残速测试剂盒对三唑磷缓冲盐溶液的抑制率结果

2.4 灵敏度评价方式的差异

目前对于农残速测仪灵敏度的评价存在提取液和蔬菜中农残含量2种方式，分别对应mg·L-1和mg·kg-1两个浓度。如根据NY/T 488—2001蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法规定，最低检出浓度分为溶液和蔬菜2种类型。GB/T 5009.199—2003和食品快速检测方法(KJ 201710)规定的检测限为质量浓度mg·kg-1。本试验中对于蔬菜和提取溶液灵敏度的差异来自两部分。首先是单位的差异，由于在提取时按照2 g蔬菜样品对应10 mL提取液，假设提取完全，则提取液灵敏度(mg·L-1)× 10 mL/2 g≈蔬菜灵敏度(mg·kg-1)，即0.06 mg·L-1毒死蜱的提取液灵敏度对应蔬菜的灵敏度为0.3 mg·kg-1，但实际上由于存在提取效率的问题，蔬菜的实际灵敏度远大于5倍。

其次，快速检测方法的提取液体系是缓冲盐溶液-蔬菜中农药残留。由于大多数有机磷和氨基甲酸酯类农药是脂溶性的，难以溶于水，故而其提取效率较低[13-14]。根据PPDB的农药性质数据库(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/atoz.htm)中可查到，在20 ℃条件下，毒死蜱在纯水中的溶解度为1.05 mg·L-1，三唑磷在纯水中的溶解度为35 mg·L-1。加缓冲盐后通常还会降低农药的溶解度。本试验在2 g青菜样品中分别添加0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷，在10 mL缓冲盐溶液提取后，分别对提取液和提取后的青菜样品进行色谱检测，结果发现，添加毒死蜱在两相中的残留浓度分别为0.009和0.39 mg·L-1，三唑磷的分布分别为0.010和0.31 mg·kg-1，经计算仅有10.3%的毒死蜱和13.9%的三唑磷能被缓冲盐溶液提取，这就解释了8种速测仪A、B、C、D、E、F、G和H对提取液灵敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，但对于5 mg·kg-1三唑磷加标的青菜样品，没有显示为强阳性却反而为阴性的原因。由于缓冲盐溶液对青菜的提取效率太低，但需要说明的是，通常蔬菜中的农药残留是在助剂溶解的农药产品施药后残留的，这些助剂和农药共同残留在蔬菜表面，可能有助于缓冲溶液对农药的提取。另外不同蔬菜种类的叶片、叶片的剪碎程度、提取时间和提取温度等因素都对速测法的灵敏度存在影响，但不可否认的是，利用缓冲盐溶液提取农药的能力太弱，不利于速测法在对蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测。

3 小结

目前市售的9种速测仪产品均不满足对青菜中添加0.1和0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷的快速检测，对于5 mg·kg-1毒死蜱的灵敏度仅有农残速测仪A和B能满足检测需要，5 mg·kg-1三唑磷的灵敏度仅有速测仪B、C、E能满足需要。9种速测仪在毒死蜱缓冲盐提取液的灵敏度差异明显，分为0.06 mg·L-1，1～5 mg·L-1和>5 mg·L-1三档，在三唑磷缓冲盐溶液的灵敏度较为集中，8种试剂盒的灵敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，1种试剂盒灵敏度为2.5 mg·L-1。农残速测仪利用缓冲盐溶液提取效率仅为10.3%～13.9%，虽然受多种因素影响，但提取效率的事实无法改变。未来对于速测方法的改良，应从添加洗涤剂或改变提取溶剂等方式以提高农药提取效率，从而优化速测方法在蔬菜中农药残留的检测。