超高效液相色谱-串联质谱法测定 铁皮石斛中啶氧菌酯残留

付岩，王全胜，张亮，朱勇，赵健，吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

啶氧菌酯是一种广谱、内吸性的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，其作用机制是通过在细胞色素b和c1间电子转移抑制线粒体的呼吸[1-2]。广泛应用于水稻、花生、黄瓜、葡萄等作物[3]，主要用于防治叶面病害如叶枯病、叶锈病、颖枯病、褐斑病、白粉病等[4]。

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生草本植物，具有很好的免疫调节作用，目前浙江省的石斛产业化基地已超过100个，种植面积近2 000 hm2，产值27亿元[5-6]。随着铁皮石斛的人工栽培和大规模种植，病虫害问题日益突出。据报道，铁皮石斛主要病害有软腐病、炭疽病，疫病，叶锈病等，在生产栽培中啶氧菌酯被用来防治叶锈病[7]。虽然啶氧菌酯毒性不大，但若使用不当造成残留超标，会对消费者的健康产生危害[8]。我国尚未制定啶氧菌酯在铁皮石斛中的最大残留限量(MRL)，欧盟规定了啶氧菌酯在草本植物中的最大残留限量为0.01 mg·kg-1[9]。目前已有对铁皮石斛中有机磷、菊酯类、三唑类等农药残留检测的相关报道[10-16]，但是铁皮石斛中啶氧菌酯残留量的测定方法尚未见文献报道。本研究采用改良的QuEChERS前处理方法，电喷雾正离子反应监测模式监测，建立了准确、灵敏和快速的铁皮石斛中啶氧菌酯UPLC-MS/MS分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Waters Xevo TQ MS超高相液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)及Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；KS4000ic恒温振荡器(德国IKA 公司)；3K15高速离心机(德国Sigma公司)；GENIUS3旋涡混合器(德国IKA 公司)；万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 试剂与材料

啶氧菌酯标准品(99%，德国Dr.Ehrensorfer公司)。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；PSA(40～60 μm，上海安谱公司)，无水硫酸镁和氯化钠均为分析纯，试验用水为Milli-Q超纯水。

1.3 样品前处理

称取铁皮石斛样品5 g置于50 mL离心管中，加入10.0 mL纯净水浸泡20 min后，加入15.0 mL乙腈，以350 r·min-1振荡提取30 min，加入 1.5 g氯化钠和4.0 g硫酸镁剧烈震荡1 min，再以9 500 r·min-1离心3 min，取2 mL上清液于5 mL离心管中，加入100 mg PSA和300 mg硫酸镁，漩涡1 min，9 500 r·min-1离心3 min。吸取净化上清液0.40 mL至另一试管中并加入0.60 mL 0.1%甲酸溶液混合均匀，过0.22 μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定。

1.4 仪器条件

色谱柱：Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈；梯度洗脱条件：B相在0.5 min内保持40%后，在1.0 min内线性增至80%，保持2.0 min，然后在0.1 min内降至40%，保持2.0 min；流速0.30 mL·min-1；进样量10 μL。ESI源正离子模式电离，多反应监测(MRM)，毛细管电压2.5 kV，萃取锥孔电压20 V，RF透镜电压0.5 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度500 ℃，锥孔气流速50 L·h-1，脱溶剂气流速1 000 L·h-1，锥孔电压为14 V；啶氧菌酯定量离子对为368.10>204.96，碰撞电压为8 eV；定性离子对为368.10>144.87，碰撞电压为14 eV。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

选择ESI+离子模式。为优化质谱条件，配制啶氧菌酯100 ng·mL-1的标准溶液。利用该标准溶液在全扫描方式下，优化毛细管电压、锥孔电压、裂解温度、脱溶剂气流速等参数，得到待测物最强的分子离子峰。然后在以上的质谱条件下，对选定的母离子进行子离子扫描，优化碰撞能量等参数。再经仪器自带Intellistart软件优化和空白样品测定后确定啶氧菌酯的定量离子对为368.10/204.96，定性离子对为368.10/144.87。

2.2 流动相的选择

经过色谱条件试验发现，选择乙腈为有机相时，同样梯度洗脱条件下出峰时间比甲醇为有机相时更快；水相中加入0.1%甲酸后，响应更高，峰型更好。因此，最终确定流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱，流速为0.3 mL·min-1。此时分析时间较短，峰型较好，出峰时间为3.0 min，保留时间适中。

2.3 标准曲线

准确称取啶氧菌酯标准品0.01 g(精确至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg·L-1的标准母液。采用基质外标法定量。将100 mg·L-1的啶氧菌酯标准母液用铁皮石斛空白基质提取液稀释配制成0.10、0.05、0.01、0.005、0.001 mg·L-1的系列标准工作液溶液。按1.4条件进行测定。以进样质量浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。分析结果表明，啶氧菌酯在0.001～0.1 mg·L-1浓度范围内线性关系良好，标准曲线方程为y=93 529 743x+97 188，R2=0.998。

图1 铁皮石斛空白基质中啶氧菌酯标准曲线

2.4 方法的灵敏度、准确度和精密度

通过3倍信噪比(S/N)计算得出方法的检出限为1×10-13g，灵敏度较高。取铁皮石斛的空白样品进行回收率试验，添加啶氧菌酯标准溶液，使添加水平分别为0.005、0.01、0.50、5.0 mg·kg-1，按前述前处理步骤进行处理，每浓度处理重复5次，基质匹配外标法定量。如表1所示，啶氧菌酯在铁皮石斛中平均添加回收率为83.3%～88.0%，相对标准偏差为2.2%～9.1%。说明该方法准确度和精密度均较好，符合农药残留分析的要求[17]。

表1 啶氧菌酯在铁皮石斛中的添加回收率

3 小结与讨论

目前，关于啶氧菌酯残留分析方法的研究报道较少，主要有超高效液相串联质谱法[2]、液相色谱法[8]、气相色谱法[18]等。胡秀卿等[2]使用乙腈提取葡萄和土壤中的啶氧菌酯，HLB小柱净化，UPLC-MS/MS测定，结果表明，仪器的最小检出量(LOD)为4×10-13g，最低检出浓度(LOQ)为0.01 mg·kg-1。孙扬等[8]采用液相色谱分析方法研究了啶氧菌酯在黄瓜中的残留，LOQ为0.02 mg·kg-1。段丽芳等[18]采用气相色谱分析方法研究了啶氧菌酯在西瓜和土壤中的残留，LOD为1×10-11g，LOQ为0.01 mg·kg-1。

本文所建立的方法采用改良的QuEChERS法提取、PSA净化，缩短了前处理时间。同时方法检出限为1×10-13g，定量限为0.005 mg·kg-1，与已报道的方法相比，灵敏度和准确度较高。本研究通过对色谱及质谱条件的优化，建立了铁皮石斛中啶氧菌酯残留的UPLC-MS/MS方法，灵敏度、准确度均符合农药残留分析的要求，可为中药材铁皮石斛中啶氧菌酯的检测提供方法依据。