土壤阿特拉津的生物修复机制的研究

蔺中 张倩 李文清 魏金华 叶小凡 丘建炜 罗舒文 甄珍

摘 要：阿特拉津主要用于一年生禾本科杂草和阔叶杂草的防除，由于其成本低、除草效果好，已迅速在世界范围内广泛使用。阿特拉津不易降解，在环境中持留时间长，频繁使用会污染农田土壤及周围水体，对生态环境和人类健康产生威胁。环境中的微生物种类基数大，容易异变，适应能力强，生物降解因具有高效、成本低，无二次污染的优点而成为研究的焦点。文章运用稳定性同位素探针技术（SIP）与各种分子生物学手段结合，展望了同位素探针技术在鉴定降解有机污染物的功能菌方面的前景。

关键词：阿特拉津 生物修复 降解菌 稳定同位素探针技术

中图分类号：X53 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2018）04（b）-0116-03

1 阿特拉津的概述

1.1 阿特拉津的性质

阿特拉津是一种选择性内吸传导型苗前苗后除草剂，常用于玉米、甘蔗、高粱和林地等。阿特拉津化学名称为氯乙异丙嗪（2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-1，3，5-三嗪），是一种均三氮苯类农药，分子式为C8H14ClN5，分子量为215.68，其化学结构式如图1所示。

阿特拉津在微酸及微碱介质中较为稳定，其纯品为白色粉末，原粉纯度在92%以上，熔点为173-175 ℃，沸点为200 ℃，20 ℃时蒸气压为4.0×10-5 Pa，。25 ℃时在水中的溶解度为33 mg·L-1，醋酸乙酯中為28000 mg·L-1，二乙醚中为2000 mg·L-1，正戊烷中为360 mg·L-1，甲醇中为18000 mg·L-1[1]。

1.2 阿特拉津的危害

阿特拉津在全球大范围使用已有40余年的历史，对生态环境造成了严重的影响。阿特拉津的化学结构稳定、不易降解，半衰期为8～52周，被微生物代谢分解的过程缓慢。同时具有广谱毒性和生物累积性，是一种典型的含氯原子致畸、致癌、致突变的“三致”污染物。

阿特拉津主要通过根部和叶片进入植物体内，大部分农作物，如水稻、小麦、黄瓜、大白菜、甘蓝等对阿特拉津较为敏感，当灌溉水中的浓度达到0.1 mg/L时，便会产生药害作用。他还可以通过食物链在动物体内传递积累，从而危害人体健康。有研究表明，阿特拉津可能引发人体细胞发生癌变，长时间接触会增大乳腺癌及卵巢癌的发生机率，同时影响人类心血管系统和再生繁殖。因此，阿特拉津已经被列入环境荷尔蒙的可疑物质并于2017年10月被世界卫生组织国际癌症研究机构列入到3类致癌物清单中。

综上所述，阿特拉津是一种残留时间长、药害大、污染严重，对人体健康产生威胁的除草剂。

1.3 阿特拉津的治理方法

目前阿特拉津污染的治理主要有物理法、物理化学法和生物修复法。物理处理方法不会改变阿特拉津的性质，污染物不仅不能从根本上得到去除，还会产生含污染物的活性炭、污泥等，造成环境二次污染，所以物理处理法较少应用于环境实际修复中。物理化学法降解阿特拉津有光解法、水解法以及氧化还原降解法。该方法存在运行成本高、耗能高、设备复杂、降解物成为二次污染物等诸多不足，故目前仍处于实验室模拟阶段，难以大面积推广。

微生物修复技术是一种利用污染土壤的土著微生物或向环境中加入人工培养驯化的具有某种特定功能的微生物，在适宜的生长条件下，通过自身的同化作用，分解环境中的污染物。从而达到降低环境中有害污染物活性或将污染物降解成无害物质的修复技术。微生物修复操作简单，处理成本低，且不会产生对环境有害的副产物，具有较高的安全性和清洁性。故该技术在实际应用中得以广泛推广，受到人们越来越多的关注。环境中的微生物种类多、繁殖快，适应能力强，易变异，同时具有较强的吸收转化能力，目前已有许多学者从环境中获得并鉴定了一些具有降解阿特拉津功能的微生物。

1.4 阿特拉津降解菌

目前报导的通过实验室驯化培养、分离纯化和诱变等手段获得的可以降解阿特拉津的功能微生物主要有细菌、真菌、放线菌和藻类四大类。

目前发现的具有降解阿特拉津的细菌和放线菌主要有假单胞菌、红球菌、节杆菌属、根瘤菌属、蜡状芽孢杆菌、藤黄微球菌属、土壤杆菌属、不动杆菌属、微小杆菌属、诺卡氏菌属、和黄单胞菌属等。假单胞细菌是目前发现能够矿化阿特拉津的最主要微生物，它在阿特拉津的矿化过程中起着重要作用。

能够降解阿特拉津的真菌有曲霉属、青霉属、根霉属、木霉属、镰刀菌属、白腐菌和酵母属等。其中白腐真菌具有较高的氧化降解能力，可降解多种环境污染物。曲霉属和青霉属主要通过脱烷基作用降解阿特拉津。藻类有衣绿藻属、纤维藻和月牙藻等[2-3]。

2 阿特拉津的生物降解

2.1 生物降解的鉴定方法

科学技术的进步，使鉴定土壤微生物多样性的技术不断改进和完善。目前生物降解的鉴定方法有：稀释平板法、以分子指纹图谱为基础的鉴定方法、高通量测序和稳定性同位素探针技术。稀释平板法是在人为添加特定碳氮源或其他营养物质的培养基上，有选择性地富集、分离和纯化所需的微生物。由于只有0.1%～1%的土壤微生物种群可以在培养基中生长，因而无法全面地鉴别土壤环境中微生物的种群构成。以分子指纹图谱为基础的鉴定方法有变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresi，DGGE）、单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）和限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）。DGGE、T-RFLP等分子生物学技术不仅可以使人们可以从表型特征研究微生物，而且可以从整个微生物界的基因群特征进行分类鉴定，使人们对土壤微生物群落结构组成的认识得到了提高，但仍不易得到有关微生物间相互作用及功能微生物的直接信息。高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）又称“下一代测序”，能一次测定几十万到几百万条DNA分子序列和一般读长较短等。该技术能够同时分析数以百计的不同环境样品，不仅对揭示微生物的遗传信息和基因表达调控起着重要作用，而且在研究复杂环境中微生物群落的组成、结构、遗传进化关系和功能活性等及反映环境中非优势、低丰度的重要污染物降解菌的功能日益突出。稳定性同位素探针技术（Stable isotope probing，SIP）将稳定性同位素标记和分子生物学手段相结合，在自然环境样品中加入富含稳定同位素的标志的营养液，原位样品中的微生物吸收营养物质以合成自身生长发育所需的物质，通过分离鉴定可以研究微生物的功能及种群构成，实现了将微生物间相互关系及其代谢途径与微生物种群结合起来的目的[2，4，5]。

2.2 同位素探针的应用

同位素探针技术主要应用于甲基氧化细菌、多碳混合物、微生物碳氮循环过程、宏基因组、原位鉴定有机污染物降解等的研究。其在有机污染物生物降解的运用主要集中于单环芳香烃（BTEX）、多环芳烃（PAHs）和多氯联苯（PCBs）的研究。

用生物修复手段降解环境中的单环芳香烃类化合物较为容易，Hanson等首次使用13C标记的甲苯，结合磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）和SIP技术研究了甲苯的微生物降解，发现土壤中16种被13C标记的 PLFA 与传统方法培养分离的能降解甲苯的功能菌的PLFA相同，证明了复杂环境中特定化合物的降解代谢可以运用PLFA-SIP技术探查。目前，越来越多的学者应用DNA-SIP技术研究环境中能降解BTEX的微生物。Pele等用此技术探测到降解甲苯的厌氧微生物的数量[6]。Manefield和Whiteley等用RNA-SIP技术确定工业反应堆中能代谢苯酚的厌氧细菌。Aburto等也用RNA-SIP技术研究地下水中能降解苯的功能微生物。

PAHs是一类具有两个或两个以上苯环的有机化合物，是许多微生物的唯一碳源。实验室分离培养的单污染物降解菌的降解途径已相当清晰，但环境往往有多种PAHs，因此需同时研究和鉴定污染土壤中多种PAHs降解菌。Zhang等、Martin等和Gutierrez等运用DNA-SIP分别从污染水体底泥、海水中鉴定出蒽降解菌和萘降解菌。Johnsen等在4种污染土壤中进行原位试验，根据实验所得PLFA图谱找出了土壤中能够降解菲的细菌。罗春玲等人运用DNA-SIP技术识别了土壤中菲的降解菌，首次发现Collimonas属的微生物具有降解PAHs的能力，Terrimonas属微生物可以降解土壤中BaP[7]。

PCBs在环境中分布广、毒性大、残留量高。起初研究其降解菌主要运用PLFA-SIP技术和DNA-SIP技术。Tillmann等用13C全标记二氯联苯，应用PLFA-SIP技术鉴别污染物生物膜中的PCBs降解菌，发现降解二氯联苯的功能菌为数量较少的伯克氏菌属，而非在体系中处于优势地位的甲基杆菌属。Uhlik等结合DNA-SIP技术和T-RFLP技术研究多氯联苯污染土壤和山葵根际的微生物，发现两种不同土壤降解菌种类均不同[2]。同时发现往PCBs污染土壤中加入芳香烃培养一段时间后，发现土壤中能代谢多氯联苯的菌也能同化萘。

因此，SIP技术与分子生物学技术结合揭示了复杂土壤环境中参与降解有机污染物的功能微生物的种类、起作用的功能基因及其之間的相互作用，这对于功能微生物的鉴定和发展起到了巨大的作用。

3 研究展望

随着人们对环境问题的重视，用于研究生物降解机理的技术手段不断被研发。稳定同位素探针技术具有高效准确等优势，为微生物生态学研究领域提供了大量的信息，为获得相关功能微生物及其功能基因方面的信息，研究有机污染物生物修复和生物降解途径提供了重要的工具，同时在探查土壤环境功能微生物群落和土壤环境中植物、动物、细菌和真菌在降解污染物中的综合作用有重要意义。

参考文献

[1] 蔺中，杨杰文，蔡彬，等.根际效应对狼尾草降解土壤中阿特拉津的强化作用[J].农业环境科学学报，2017，36（3）：531-538.

[2] 吴志豪.蚯蚓对土壤阿特拉津降解的影响和机理研究[D].广东：华南农业大学，2016.

[3] 吴倩倩.生物炭增强土壤吸附阿特拉津的作用及机理[D].浙江：浙江大学，2016.

[4] 周宁，孟庆娟，王荣娟，等.除草剂阿特拉津微生物降解研究进展[J].东北农业大学学报，2008，39（9）：136-139.

[5] 王雲.莠去津降解菌的分离鉴定、降解特性和机理及其修复效果[D].浙江：浙江大学，2016.

[6] 蔺中，孙礼勇，陈昊，等.稳定性同位素探针技术在土壤功能微生物原位鉴定的应用[J].农业环境科学学报，2012，31（1）：1-6.

[7] Song M.Identification of benzo[ a]pyrene-metabolizing bacteria in forest soils by using DNA- based stable- isotope probing[J].Applied & Environmental Microbiology，2015，81（21）：7368-7376.