海风藤总黄酮抗氧化应激损伤作用研究

胡昱月

（河南省南阳市中心医院中药科，河南 南阳 473000）

心血管疾病发病率高，并发症多［1］。目前研究表明主要与血管内皮细胞功能紊乱有关［2］。血管内皮紊乱多与氧自由基引起的过氧化反应有关［3］。由于中药的多成分、多靶点的独特优势，研究热点多从植物中寻找天然的抗氧化活性物质。海风藤为胡椒科植物风藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤茎，味辛、苦，性微温，具有祛风湿，通经络，止痹痛的功效［4］。现有研究表明海风藤具有抗氧化作用［5］。本研究采用过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激损伤模型，探讨海风藤总黄酮的抗氧化作用及其作用机制，总结如下。

1 材 料

细胞。人脐静脉内皮细胞human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）购自中国典型培养物保藏中心（武汉）。

仪器。LT-CIX250FTCO2细胞培养箱［立德泰勀（上海）科学仪器有限公司］，全自动酶标仪（上海拜格生物科技发展有限公司），MF53倒置荧光显微镜（广州市明美光电技术有限公司），高速离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）。

药物与试剂。海风藤购自张仲景大药房，干燥后，称取200.05g，95%乙醇80℃回流提取3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩至干燥，所得粉末为海风藤总黄酮，得率为2.15%。MTT（武汉百浩天生物科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）测试盒（北京索莱宝科技有限公司）。内皮素1（Endothelin 1，ET-1）酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）试剂盒、白细胞介素6（Interleukin6，IL-6）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒、白细胞介素8（Interleukin8，IL-8）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）。

2 方 法

海风藤总黄酮对过氧化氢诱导的氧化应激损伤的保护作用。取对数生长期的HUVECs细胞，消化离心，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔板中每孔100µL，24h后，分别加入终浓度为0.1、0.5、1、2、4mg/mL海风藤总黄酮，阳性组加入依达拉奉（10µmol/L），空白组和模型组加入等容量的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS），孵育48h后，加入终浓度为1200µmol/L的过氧化氢，空白组加入PBS，培养箱中继续培养8h［6］，测定OD值，计算HUVECs细胞存活率。存活率=（各实验组OD值/正常对照组OD值）×100%。

SOD、MDA、NO含量测定。取对数生长期的HUVECs细胞，消化离心，调整细胞浓度为1×104/mL，每孔接种2mL于12孔板中，贴壁后，分别加入终浓度0.5、1、2mg/mLh海风藤总黄酮，阳性组加入依达拉奉（10µmol/L），空白组和模型组加入等容量的PBS，孵育48h后，加入终浓度为1200µmol/L的过氧化氢，空白组加入PBS，培养箱中继续培养8h，收集细胞上清液按照试剂盒说明书测定SOD、MDA、NO含量。

ELISA法检测细胞上清液中ET-1、IL-6、IL-8含量。取对数生长期的HUVECs细胞，消化离心，调整细胞浓度为1×104/mL，每孔接种2mL于12孔板中，贴壁后，分别加入终浓度0.5、1、2mg/mL海风藤总黄酮，阳性组加入依达拉奉（10µmol/L），空白组和模型组加入等容量的PBS，孵育48h后，加入终浓度为1200µmol/L的过氧化氢，空白组加入PBS，培养箱中继续培养8h，收集细胞上清液每孔加入待测细胞上清液50µL；样品孔中加入40µL样品稀释液和10µL样品，空白孔除外；用封板膜封板后，37℃孵育反应30min；洗涤，每孔加入酶标试剂50µL，空白孔除外；温育、洗涤、显色在450nm测定各孔的OD值，根据样品的OD值计算ET-1、IL-6、IL-8含量。

统计学方法：用SPSS19.0软件进行统计分析，计数资料以（±s ）表示、用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs存活率的影响。如表1所示，过氧化氢的诱导损伤可导致HUVECs细胞存活率降低，海风藤总黄酮可显著提高过氧化氢损伤HUVECs细胞的存活率，其中1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL组与模型组比较有显著性差异，且4mg/mL组与2mg/mL比较存活率有所降低，所以后续试验仅研究0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL3个组的作用。

表1 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs存活率的影响 （±s）

表1 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs存活率的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 给药剂量 存活率/%空白组 100.00±0.00模型组 57.28±6.54*阳性组 10µmol/L 79.32±8.13#海风藤总黄酮 0.1mg/mL 56.34±5.15 0.5mg/mL 68.35±4.27#1mg/mL 77.31±5.34#2mg/mL 83.16±7.53#4mg/mL 78.23±7.39#

海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs氧化应激损伤SOD、NO、MDA的影响。如表2所示，与正常对照组比较，模型组细胞SOD、NO水平有显著降低，MDA水平升高；海风藤总黄酮作用后，与模型组比较海风藤总黄酮0.5mg/mL组可显著提高NO水平，降低MDA水平；海风藤总黄酮1mg/mL、2mg/mL组可显著提高SOD、NO水平，降低MDA水平。

表2 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs细胞氧化应激损伤SOD、NO、MDA的影响 （±s）

表2 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs细胞氧化应激损伤SOD、NO、MDA的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

MDA（µmol/L）组别 给药剂量 SOD（U·mL）NO（µmol/L）空白组 50.24±5.43 7.12±0.74 91.16±9.21模型组 30.78±3.65*27.38±1.53*56.33±6.15*阳性组 10µmol/L45.52±5.11*#10.97±1.25*#78.32±7.53*#海风藤总黄酮 0.5mg/mL 36.53±3.54*20.19±1.76*#66.37±6.82*#1mg/mL 42.45±4.51*#14.46±1.24*#71.74±6.85*#2mg/mL 46.35±3.96*#12.83±1.35*#73.69±7.73*#

海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs氧化应激损伤ET-1、IL-6、IL-8的影响。如表3所示，与正常对照组相比，模型组细胞ET-1、IL-6、IL-8水平有显著升高；海风藤总黄酮作用后，与模型组比较海风藤总黄酮0.5mg/mL组可显著降低ET-1、IL-6、IL-8水平；海风藤总黄酮1mg/mL、2mg/mL组可显著降低ET-1、IL-6、IL-8水平。

表3 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs细胞氧化应激损伤ET-1、IL-6、IL-8的影响 （±s）

表3 海风藤总黄酮对过氧化氢损伤HUVECs细胞氧化应激损伤ET-1、IL-6、IL-8的影响 （±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 给药剂量 ET-1（ng/L） IL-6（ng/L） IL-8（ng/L）空白组 83.12±5.94# 24.39±1.12#406.52±12.34#模型组 122.46±4.89* 32.67±2.31*589.32±31.41*阳性组 10µmol/L 95.38±3.54*# 26.51±1.82*#451.27±28.19*#海风藤总黄酮 0.5mg/mL 119.26±4.35*#29.65±2.19*#499.37±18.79*#1mg/mL 108.65±3.63*#27.33±1.38*#472.41±22.33*#2mg/mL 95.92±2.58*# 26.44±2.06*#42.63±19.89*#

4 讨 论

氧化应激是机体内氧化与抗氧化的平衡被打破，导致机体出现氧化损伤，造成细胞衰老、凋亡或死亡，为许多疾病的发病机制，与心血管损伤关系密切，参与动脉粥样硬化的发生和发展［7］。细胞内的能量代谢和生物氧化主要在线粒体中进行，细胞内活性氧的增加会导致氧化损伤，细胞内的ROS主要来源于线粒体［8］。因此，抑制细胞的氧化应激、抗氧化应激损伤，对防治心血管疾病具有重要的临床意义［9］。H2O2是一种活性氧，可透过细胞膜氧化细胞内的生物大分子，从而造成氧化损伤。

研究结果表明，H2O2引起的氧化应激损伤使HUVECs的存活率显著降低；海风藤总黄酮可显著提高氧化应激损伤HUVECs的存活率，SOD和MDA是判断细胞内的氧化应激的指标，SOD是抑制过氧化物产生的重要的内源性抗氧化酶，MDA是脂质过氧化物，可以对细胞产生损伤作用［10］。

海风藤总黄酮作用后，可显著改善由H2O2造成的细胞内SOD水平下降，MDA水平升高的现象，SOD水平升高，MDA水平下降。ET-1是缩血管因子，内皮受损后细胞内ET-1合成增加，NO则相反，内皮受损后合成降低。海风藤总黄酮可降低ET-1水平，升高NO水平，起到保护内皮细胞的作用。

IL-6和IL-8是重要的炎症因子，内皮功能紊乱与其水平的升高密切相关，可通过直接作用或间接调节粘附分子表达来吸引炎症细胞，本研究表明，海风藤总黄酮可降低IL-6、IL-8水平。海风藤总黄酮可保护由过氧化氢诱导的HUVECs氧化应激损伤，其机制可能与调节SOD、MDA、ET-1、NO、IL-6、IL-8等氧化应激及炎症相关因子。通过体外实验进一步验证了海风藤总黄酮较强的抗氧化作用，初步证实了其保护血管内皮细胞的机制。