高效液相色谱-串联质谱法测定玩具中双酚A的迁移量

李函珂,张 青,黄宁珊,周懿琦,林捷聪,林绍鹏,田 勇,蚁乐洲,刘崇华,黄理纳

(广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623)

作为一种用于制造塑料、环氧树脂和其他材料的化合物，双酚A(BPA)数十年来被大量生产和广泛使用，已经导致人类的普遍暴露[1]。同时，双酚A也是一种内分泌干扰物，可干扰激素的合成及代谢，且与人体生殖系统的多种病变相关，如前列腺增生和女性性早熟[2-3]。对于儿童,研究亦表明双酚A暴露或导致儿童肥胖且可能对学习和记忆能力有副作用[4-5]。此外，妊娠期双酚A暴露还可能影响儿童在3岁左右时的行为和情绪调节能力[6]。

鉴于双酚A的暴露风险和儿童易受伤害的特质，欧盟 1272/2008号法规将双酚A归为第2类生殖毒性物质[7]。2014年，欧盟指令2014/81/EU明确规定玩具中单体双酚A的迁移量不得高于 0.1 mg·L-1[8]。然而，由于欧洲食品安全局在2015年建议将双酚A的每日耐受摄入量(TDI)临时设为4 μg·kg-1·d-1[9],欧盟委员会的玩具安全专家组决定采用3 μg·kg-1·d-1作为双酚A的TDI,最终使得玩具中双酚A的迁移量在(EU)2017/898指令中被进一步降至 0.04 mg·L-1[10]。为了解特定条件下儿童与玩具的口部接触双酚A迁移量，欧盟玩具安全标准EN 71-10：2005给出了迁移条件，其中以水作为模拟液[11]，同时EN 71-11：2005还给出了测定双酚A迁移量的高效液相色谱-二极管阵列-荧光检测(HPLC-DAD-FLD)方法[12]。然而，上述标准所采用的迁移条件和检测方法均已过时，其中，EN 71-9：2005中所采用的迁移温度(20 ℃)不能代表口部接触过程中可预见的最坏情形，且EN 71-10：2005中检测方法的定量下限已接近2017/898指令中规定的双酚A迁移限量[12]，故已无法满足新指令的限量要求。因此，须采用更为合理的迁移条件并建立更可靠、灵敏的检测方法，其定量下限通常应不高于限量的1/10(即LOQ≤4 μg·L-1)。双酚A的测定已被广泛研究，主要包括酶联免疫法(ELISA)[13]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[14]，以及高效液相色谱(HPLC)与荧光检测器(FLD)[15]、电化学检测器(ECD)[16]、质谱检测器(MS)[17]或串联质谱检测器(MS/MS)联用的方法[18-19]。上述方法中，HPLC-MS/MS法因可检测亚ppb级的双酚A且受干扰和基体效应的影响小，而得到广泛应用。

本文旨在建立和优化适于检测痕量双酚A迁移量的HPLC-MS/MS方法。同时，在实验中亦发现聚酰胺(PA、尼龙66)和聚醚砜(PES)的针式过滤器可导致双酚A的大量损失，但一些标准方法并未对该问题足够重视，甚至存在错误，故按标准流程操作后可能获得双酚A迁移假阴性[20-21]。为此，本文首次系统全面地研究了迁移溶液过滤时所用针式过滤器对双酚A回收率的影响，测定了玩具样品的双酚A迁移量，以评估玩具的双酚A暴露水平。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1200系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司)、3200 QTRAP三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司)、SW22 型恒温水浴振荡器(德国Julabo公司)。

双酚A标准物质(纯度99.8%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司)。甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；实验所用去离子水均取自Milli-Q Direct 纯水系统，电阻率不低于18.2 MΩ·cm。

0.45 μm 和 0.22 μm 混合纤维素(MCE)针式过滤器购自天津领航实验设备股份有限公司；0.45 μm 和 0.22 μm 聚酰胺(PA，尼龙66)、聚醚砜(PES)和聚四氟乙烯(PTFE)针式过滤器购自天津津腾实验设备有限公司；直径约0.7 μm 四甲基氯硅烷(TMCS)去活的玻璃棉购自德国CNW Technologies公司；自制不同材质塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)，材质包括丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)、聚碳酸酯(PC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯(PP)和聚亚苯基砜(PPSU)；含约10 g/kg双酚A的自制聚氯乙烯(PVC)塑料片(50 mm×10 mm×1.0 mm)。

玩具样品均购自广州本地市场，包括玩具赛车、变形金刚玩具、玩具手枪和益智玩具套装。

1.2 标准溶液配制

准确称取一定量双酚A，用甲醇配制为100 mg·L-1的双酚A标准储备溶液；用超纯水将上述溶液逐级稀释，得到质量浓度为2、5、10、 20、50、100 μg·L-1的双酚A标准工作溶液。

1.3 样品前处理

样品前处理程序基于EN 71-9:2005条款6并进行了修改[11]：将玩具样品剪为若干表面积为(10±1.0) cm2的小片，剪切过程中使玩具的不可接触及内表面的面积最小。其后，将小片置于250 mL三角瓶中，并加入预热至40 ℃的100 mL 水作为模拟液。将三角瓶加塞密封后，置于40 ℃恒温水浴中，以150 r/min的频率振荡迁移1 h。迁移完成后，取一定体积模拟液，用MCE针式过滤器过滤后直接进行HPLC-MS/MS分析。

1.4 仪器条件

1.4.1色谱条件色谱柱：Poroshell 120 EC-C18RRHD 柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国Agilent公司)；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃；流动相：水(A)-甲醇(B)。梯度洗脱程序：0～4.00 min，50%～95% B;4.00～6.00 min，95% B;6.00～6.10 min，95%～50% B;6.10～10.00 min，50% B。流速：0.35 mL·min-1。

1.4.2质谱条件电离模式：ESI-；检测方式：多重反应监测(MRM)；喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：600 ℃；气帘气压力：241.3 kPa；雾化气压力：241.3 kPa；辅助气压力：310.3 kPa；仪器控制和数据分析软件：Analyst 1.6.2。优化后得到两对响应较强的离子对m/z227.1/133.3、m/z227.1/211.1，其中m/z227.1/133.3用于定量，对应的去簇电压、碰撞能量和碰撞池出口电压分别为-58、-36、-4.0 V；m/z227.1/211.1用于辅助定性，对应的去簇电压、碰撞能量和碰撞池出口电压分别为-58、-33、-4.8 V。

2 结果与讨论

2.1 迁移条件的选择

图1 不同迁移温度下的双酚A迁移量(n=3)Fig.1 BPA migration under different temperatures during migration(n=3)

考虑到迁移条件应能够代表双酚A对儿童暴露的可预见的最坏情形，本实验以欧盟玩具标准EN 71-10:2005所采用的迁移条件进行修改。所用模拟液为去离子水，这是由于去离子水被广泛用作模拟口部接触过程中双酚A暴露的模拟液[15,22-23]。此外，由于口部接触时的温度通常接近人体体温(即37 ℃)，且Van Engelen等[24]建议若接触温度在20～40 ℃范围内，则迁移温度应选用40 ℃，因此本研究将迁移温度设为40 ℃，这与EN 71-10:2005所采用的20 ℃不同[11]。图1为不同温度下含约10 g/kg双酚A的PVC塑料片的双酚A迁移量，由图可见，当迁移温度由20 ℃升至40 ℃后，双酚A迁移量显著上升，幅度达164%，该结果也进一步说明相较于20 ℃，40 ℃更能代表口部接触时的最坏情形。

根据De Groot 和Juberg 等对儿童口部接触时间的研究，将迁移时间设为1 h[25-26]。而根据 Könemann 等[27]的研究，选用10 cm2作为样品的表面积，以代表一个可轻易被儿童咬住的物体的最大表面积。

2.2 针式过滤器的影响

针式过滤器因操作简便，常被用于液相色谱上机前溶液的过滤，常用过滤器的材质包括PA、PTFE等[28-29]。已有研究表明PA和PES过滤器均会导致双酚A在过滤时大量损失[29-30]，因此，本研究采用MCE、PA、PES和PTFE 4种常用的不同材质过滤器对添加不同浓度(5、20、100 μg·L-1)双酚A的水和甲醇进行过滤，滤液由HPLC-MS/MS测定并计算双酚A回收率，结果如图2。可见，经不同孔径的PA和PES过滤器过滤后，水溶液中的双酚A均大量损失，且仅当其达100 μg·L-1时才可被检测到(图2A)；0.45 μm的PTFE过滤器对双酚A的回收率虽高于90%，但该过滤器无法完全过滤细小颗粒物，仍可导致液相色谱六通阀及色谱柱的堵塞；而用0.22 μm的PTFE过滤器时双酚A损失则高达23%，表明双酚A的回收率可能与过滤器的孔径大小存在一定关联；MCE过滤器对双酚A的回收率均高于90%，可归因于双酚A与纤维素酯之间的相互作用较弱，且MCE过滤器中加入的醋酸纤维素可能抑制了双酚A的吸附[30]，因此MCE过滤器可满足本实验要求；玻璃棉对双酚A的回收率也均高于90%，但由于玻璃棉(GF)常用于对采集的水样进行过滤以去除其中可见的固体颗粒，仍可能导致液相色谱仪堵塞，故不适用于本实验[31]。此外，由图2B可见，不同浓度的双酚A甲醇溶液经PA和PES过滤器过滤后，其回收率明显高于双酚A水溶液，此结果亦得到 Salgueiro-González等[28]的证实，可归因于甲醇对双酚A的洗脱能力强于水。但对0.22 μm的PES过滤器和0.45 μm的PA过滤器而言，仍有高达20%的双酚A损失，表明此两种过滤器对双酚A的保留机制不同，且过滤器材质会显著影响双酚A的回收率[32]。

将经不同体积分数(0%、25%、50%、75%、100%)甲醇溶解的100 μg·L-1双酚A溶液分别由PA和PES过滤器过滤后，测定双酚A的回收率，以考察甲醇含量对双酚A回收率的影响。由图可见，双酚A的回收率随甲醇体积分数的增大而增加(图3A)，可归因于甲醇对双酚A的洗脱能力强于水。此外，仅25%的甲醇就可大幅提高双酚A的回收率，可能是由于双酚A在甲醇中的溶解度远大于水中[33]。此性质为仅有PA或PES过滤器可用时提供了一个降低双酚A过滤损失的替代方法，即将迁移溶液与甲醇按一定比例混合。

而Hebig等[34]研究也表明，使用针式过滤器时，通过弃掉一定体积的滤液，可大幅降低待测物在过滤时的损失，即过滤器中的吸附位点可被待测物饱和而在继续过滤时不再损失。本实验将100 μg·L-1的双酚A水溶液分别由PA和PES过滤，但分别弃掉前0、1、2、5、10、15 mL滤液，以研究弃掉滤液体积与双酚A回收率的关系(图3B)。由图可见，通过弃掉一定体积的滤液，双酚A损失逐渐降低，且当弃掉滤液体积达15 mL时，除0.22 μm的PES过滤器损失了15%的双酚A外，其余各过滤器的双酚A回收率均已接近100%。进一步实验表明，当弃掉滤液体积达25 mL时，该过滤器的双酚A回收率升至100%，表明其吸附位点最多，故对双酚A的吸附最强。若待过滤溶液中双酚A浓度更低，则为使双酚A回收率接近100%所需弃掉的滤液体积亦更多。同时，上述结论也为仅有PA或PES过滤器可用时提供了另一个降低双酚A过滤损失的替代方法。但不论通过将待过滤溶液与甲醇混合亦或弃掉一定体积滤液，均远不及直接使用MCE过滤器便捷，且后者对于大批量样品处理更为有利，因此本文采用MCE直接过滤。

2.3 仪器条件的优化

2.3.1色谱条件的优化本实验采用梯度洗脱，一方面是由于梯度压缩效应可得到更窄的色谱峰[35]，有利于提高方法的灵敏度，另一方面，由于流动相的溶剂强度在洗脱过程中不断增大，亦有利于减少色谱柱内的累积污染。同时，考虑到双酚A的logKow值为3.0，且本文所用的液相色谱仪器的压力上限为60 MPa，因此本实验选用Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)进行分离。由于双酚A的一、二级电离常数分别为9.4±0.3(pKa1)和10.37±0.07(pKa2)[36]，在水-甲醇体系(pH≤7.0)中其电离可忽略且主要以分子形式存在，故本研究采用水-甲醇作为流动相。

2.3.2质谱条件的优化在负离子模式下对双酚A进行母离子扫描，得到去质子离子峰，即[M-H]-。其后，调节去簇电压(DP)，使其响应最高。确定母离子后，继续进行子离子扫描，其中m/z133.3和m/z211.1两个子离子的响应最高(图4A)，其形成可归因于[M-H]-离子失去了CH4和C6H6O基团[37]。其后，调节碰撞能量(CE)和碰撞池出口电压(CXP)使子离子响应最高。经优化，m/z227.1→133.3的响应最高，因此选其作为定量离子对。优化后的MRM参数如“1.4.2”所示。

上述优化条件下，50 μg·L-1双酚A溶液的提取离子色谱图(XIC)如图4B所示。

图4 双酚A的碰撞诱导解离质谱图(A)及提取离子色谱图(50 μg·L-1)(B)
Fig.4 Collision-induced dissociation(CID)mass spectra of BPA(A) and extracted ion chromatograms(XIC) of BPA(50 μg·L-1)(B)

2.4 线性范围、检出限与定量下限

按“1.2”方法配制双酚A系列标准工作溶液，在优化条件下进行HPLC-MS/MS分析。以得到的峰面积(y，counts)为纵坐标，双酚A的质量浓度(x，mg·L-1)为横坐标作图，得到线性方程为y=4 220x-2 062，相关系数(r2)为0.999 4，曲线各点的回测精度为94.7%～110%，表明双酚A在0.002～0.1 mg·L-1范围内线性良好。此外，取ABS、PC、PET、PP和PPSU塑料片若干，加入一定量双酚A标准溶液，按“1.3”方法处理，以得到的双酚A浓度标准偏差的3倍和10倍分别作为方法检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果显示，本方法的检出限和定量下限分别为0.30～0.52 μg·L-1和1.00～1.72 μg·L-1(表1)。

表1 不同材质塑料片中双酚A的加标回收率、相对标准偏差(n=7)、方法检出限及定量下限Table 1 Spiked recoveries,RSDs,LODs and LOQs(n=7) of BPA in plastic sheets made of different materials

(续表1)

MaterialSpiked(μg·L-1)Found(Mean±SD)(μg·L-1)Recovery(%)RSD(%)LOD(μg·L-1)LOQ(μg·L-1)100103±5.11035.0PC22.1±0.11066.70.451.502019.8±0.599.12.4100100.1±2.11002.1PET21.9±0.196.55.40.321.082019.6±0.897.74.3100101.8±4.01024.0PP22.1±0.21068.60.521.722020.8±1.51047.110096.8±7.296.83.7PPSU21.9±0.196.75.40.321.082020.6±0.51032.2100101.4±3.01013.0

2.5 回收率与相对标准偏差

以不同材质阴性塑料片为样品，将其浸入模拟液后，分别添加不同浓度的双酚A标准溶液，得到方法的回收率和相对标准偏差(RSD)。由表1可见，3个加标水平下双酚A的回收率为96.5%～106%，RSD为2.0%～8.6%，表明本方法的准确度和精密度良好。此外，还测定了阳性PVC塑料片的双酚A迁移量，以考察方法的日内和日间精密度。结果表明，该阳性PVC塑料片的日内和日间双酚A迁移量分别为(4.3±0.2) mg·L-1和(4.1±0.3) mg·L-1，日内和日间RSD分别为4.0%和8.7%，表明本方法具有良好的日内和日间精密度。

2.6 实际样品的测定

将本方法用于从广州本地市场所购玩具的双酚A迁移量测定，对所购玩具样品上共计26个可触及的塑料部件进行测试，以评估双酚A的暴露水平。结果表明，上述塑胶部件的双酚A迁移量均低于本方法的定量下限，满足欧盟指令(EU)2017/898的要求。

3 结 论

本研究在欧盟玩具安全标准EN 71-10：2005的基础上改进了迁移条件并建立了可靠且能直接检测痕量双酚A迁移量的HPLC-MS/MS方法，采用的迁移条件能够代表儿童与玩具口部接触过程中可预见的最坏情形，且方法的定量下限低至1.00～1.72 μg·L-1，可满足2017/898指令中双酚A限量(0.04 mg·L-1)的要求。研究表明，当样品中含有大量双酚A时，仅有极少数可迁移至模拟液中，故即使双酚A迁移测试合格的样品或仍含有大量双酚A，因此双酚A的潜在暴露风险仍然存在。同时，MCE过滤器的双酚A损失最小，PA和PES过滤器的双酚A损失最大，因而前者更适于迁移溶液的过滤。本研究亦提出了当仅有PA和PES过滤器可用时的两种替代方法，即可将待过滤迁移溶液与甲醇混合或在过滤时弃掉一定体积的滤液，以减少双酚A在过滤时的损失。