单颗粒荧光闪烁现象、机理与应用

2018-10-25 09:15陈方圆
分析测试学报 2018年10期
关键词:量子现象荧光

陈方圆,苏 华,王 伟

(南京大学 化学化工学院 生命分析化学国家重点实验室,江苏 南京 210023)

单分子检测技术始于20世纪80年代末,随着各种显微技术的发展,人们得以了解单分子水平上的物理与化学过程。1989年,Moerner等[1]在液氦条件下检测到嵌于对三联苯晶体中的单个染料分子并五苯的吸收信号,这是首次在单分子水平上开展的实验研究。随后几年,单分子检测技术由低温检测发展到常温检测,由最初单分子光谱[2]的测定,到利用近场扫描光学显微镜[3]、远场共聚焦荧光显微镜[4]以及全内反射荧光显微镜[5]等技术实现单分子荧光成像,并由此发现了许多单分子尺度特有的新现象。例如,1994年Moerner等[6]在低温条件下,首次发现在固体基质中的单个Terrylene分子会在两种状态间切换,并通过改变激光功率证明该现象由光照引起。1996年,Brus等[7]发现单个CdSe量子点的发光在激光的连续照射下并不连续,而是在“亮态”和“暗态”之间随机、频繁转换,表现出显著的间歇性,并推测其不发光的“暗态”与光致电离过程有关。1997年,Moerner与钱永健等[8]观察到绿色荧光蛋白(GFP)的突变体T203F和T203Y的单分子荧光强度随时间波动,是蛋白质分子荧光闪烁现象的最早报道。

图1 一个CdSe/ZnS量子点荧光发射强度的时间曲线Fig.1 Representative fluorescence emission intensity curve of a single CdSe/ZnS quantum dot

上述单个荧光生色团在连续的激发光照射下间歇性的荧光发射现象称为荧光闪烁(Fluorescence intermittency,俗称Photobinking)。图1显示了一个CdSe/ZnS量子点的典型荧光闪烁曲线。在稳定光源的持续照射下,其荧光发射会在明暗之间波动:明是分子荧光处于发射态(“On state”),暗是分子荧光处于非发射态(“Off state”)。每一个状态持续时间不等,典型时间范围从毫秒到数分钟[9-10]。荧光闪烁现象具有以下典型特征:首先是个体之间的不同步性。不同个体的荧光闪烁现象并不同步,因此含有大量生色团个体的宏观体系由于系综平均效应无法观测到这一闪烁现象,而是具有稳定的荧光发射。例如,利用稳态荧光光谱仪对含有大量荧光分子的溶液进行测量时并不能观察到荧光闪烁。不仅如此,对于粒径较大且结晶度较差的荧光纳米材料,即便在单颗粒水平上测量也不易观察到荧光闪烁现象。这主要是由于此类材料往往包含较多荧光生色中心。因此,荧光闪烁现象本质上是单个荧光生色中心的特征,而不是单个物理个体的特征。其次,对单个荧光生色团而言,其荧光发射强度的时间曲线具有随机性、显著性和频繁性[11-12]。随机性主要表现在单一发射态和非发射态的持续时间缺乏明显规律,往往在毫秒和数分钟之间随机分布。尽管对大量事件的统计分析表明其持续时间服从一定的统计规律(如幂律分布)[9],但单一事件本身无法预测,而且受外界环境的影响规律尚不明确[13]。显著性表现在两个状态之间的发光强度之间存在明显差别,通常表现为强烈荧光发射和完全无发射两种状态之间的切换。这一特征有别于荧光相关光谱分析中由于分子热运动引起的荧光强度微小波动或涨落。频繁性表现为在较短的观测窗口(通常为数分钟)内状态切换事件频繁发生,而非有限的几次状态切换。

自发现以来,对荧光闪烁机理的探索在相当程度上提升了人们对分子,特别是半导体光物理过程的认识和理解。尽管目前科学界一般认为这一现象与半导体材料的光致电离和无辐射俄歇过程有关,但许多细节仍有很大争议[14-15]。不仅如此,对于以荧光量子点作为生物成像探针的应用而言,频繁出现的暗态不利于定量和空间定位。对于基于大量半导体的光电显示和转换器件而言,暗态的存在将光能以热辐射的形式加以损耗,从而降低了器件效率。然而荧光闪烁现象不仅为超分辨荧光成像技术的发展提供了原始的启发[16-17],近年来更为半导体异质结[18]和纳米化学[19]等领域带来了许多新的潜力和机遇。因此,探究荧光闪烁机制具有重要的理论和现实意义。

1 荧光闪烁的光物理机制

1.1 有机荧光分子

相对而言,有机荧光分子的荧光闪烁机制较为明确。1995年,Bräuchle等[20]通过记录单个有机染料分子(Terrylene)荧光强度的自相关函数获取其系间窜跃速率(S1~T1,T1~S0),进而提出分子系间窜跃到三线态(寿命较长)导致产生暗态的观点。2003年,Orrit等[21]发现罗丹明6G分子的暗态由三线态引起,并通过构建理论模型验证了三线态作为中间态而导致荧光分子长期不发光的结论,首次发现光诱导电荷转移也是引起荧光闪烁的原因之一。之后,Ha等[22]发现Trolox(一种水溶性VE类似物)是良好的三线态猝灭剂,能够有效抑制单分子荧光闪烁现象。

1.2 量子点

Efros等[23]于1997年提出量子点荧光闪烁的off态是由于带电激子俄歇复合引起。尽管许多细节仍有待阐明和完善,这一观点的基本框架已被人们普遍接受。当1个不带电的量子点在光照下被激发将产生电子和空穴(激子),电子和空穴复合发射出光子,即产生荧光。若量子点带电(中性颗粒发生电荷分离),在光激发下又产生1对电子空穴对时,激子和这个多余的电荷相互作用,将发生快速非辐射跃迁俄歇过程。由于俄歇复合速率比辐射复合速率高几个数量级,所以荧光过程在很大程度上被抑制,量子点则处于非发射态,off态由此产生。直至量子点中这个多余的电荷被中和,量子点在光照下产生激子,电子和空穴复合产生荧光,量子点返回on态。总体上,量子点荧光闪烁过程是光照引起量子点带电,发生on-off的转变;而当量子点中的电子被中和后,发生off-on的转变[24]。

Efros建立的模型为探究荧光闪烁机制奠定了坚实基础。然而,该模型存在一个与实验现象不符的问题,即它预测的on/off-time统计分布呈单一指数关系[14]。因此,人们在此模型的基础上进行了一系列修正,提出了多种模型解释on态和off态持续时间的概率密度与on/off-time成幂函数的倒数关系的规律,即幂律分布(Power-law distribution)。主要提出了以下模型:①Verberk等[25]构建的多载流子陷阱模型,成功地解释了power-law统计中off-time的概率分布,但未能解释on-time的power-law分布。②Shimizu等[26]构建的能级漂移模型,以及在此基础上,Tang等[27]提出的量子点和捕获态能级均发生漂移的观点,这一理论预测到on/off-time的power-law分布的斜率在较长时间为1.5,而在较短时间为0.5,与实际1~2之间分布的规律不符。③Margolin等[28]构建的空间跳动模型,该理论模型预测的on/off-time斜率为1.5,然而实验结果显示斜率可在1~2之间变化。而且,此模型中电子有可能再也回不到量子点内部,从而使量子点不再发光,与实验不符。④Kuno等[29]构建的势垒波动模型,电子隧穿势垒的高度和宽度存在波动,在隧穿过程中,局域环境的变化使得on-off和off-on的转变速率发生变化,而此模型中隧穿速率的6个数量级的变化与实验不符。

上述模型均是基于荧光闪烁由带电激子引起的俄歇复合导致,需要长寿命捕获态,被称为A型荧光闪烁。但这些模型难以解释power-law中连续的寿命分布。与A型荧光闪烁相对应,不需要长寿命捕获态和俄歇复合的模型,称为B型荧光闪烁[15]。

图2 B型荧光闪烁的机制示意图[15]Fig.2 Schematic of Type-B blinking mechanism[15]

B型荧光闪烁中,空穴被寿命约为1 μs的捕获态捕获,与导带电子发生非辐射复合产生off态,电子被激发和复合后,量子点迅速回到中性基态。在这类荧光闪烁过程中,捕获速率随时间波动,当捕获速率远大于辐射复合速率时,量子点在一段时间处于off态。具体过程为:空穴捕获速率kt远小于量子点的辐射复合速率kr,量子点发出荧光,即on态(图2A);当kt增大,且大于kr时,会发生on~off的转换(图2B);kt远大于kr,量子点处于off态(图2C);当kt变小,且小于kr时,发生off~on的转换(图2D)。

关于B型荧光闪烁,Frantsuzov等[30]提出非辐射复合速率波动模型。量子点中电子在最低的两个电子能级间跃迁1S(e)~1P(e),跃迁产生的能量漂移调控空穴的捕获速率(图2E)。此模型很好地解释了连续的寿命分布,但得到的power-law中on和off的指数数值为1.5。Barnes等[31]对此模型进行改进(图2F),提出多复合中心模型,成功解释了在交换配体后,量子点的荧光闪烁得到抑制的现象。

目前,量子点荧光闪烁机制的基本框架已搭建,且上述理论模型能够解释大多数实验结果,但单独任何一个模型均不能解释所有的实验现象和结果。特别是A型荧光闪烁中量子点电离和中性化的机理尚未明确。

2 具有荧光闪烁现象的纳米材料

随着纳米科学的发展,人们发现许多种类的纳米材料具有优异的荧光性能。单颗粒荧光光谱与成像研究显示,其中一些纳米材料表现出荧光闪烁行为,主要包括半导体量子点、碳纳米点、聚合物点和金属团簇等。由于光致发光机理的不同,另一些常见的荧光纳米材料(如上转换材料、碳纳米管等)的荧光闪烁特性则较不明显。需要指出的是,这些认识并非一成不变,而是有望随着测量科学和材料学科的进一步发展得到深化和革新。

2.1 半导体量子点

以CdSe为代表的Ⅱ-Ⅵ族量子点以其优异的量子效率和光稳定性,以及成熟的合成方法一直是荧光闪烁研究最重要的模型体系。单颗粒荧光成像揭示的闪烁现象和机制为科学家们合成长时间处于on态的量子点指明了方向[11,32]。有关CdSe量子点荧光闪烁已有许多综述发表[15,24]。由于Ⅱ-Ⅵ族量子点镉元素潜在的毒性,以InP为代表的Ⅲ-Ⅴ族无镉量子点得到了发展。单颗粒荧光成像研究表明,InP同样具有荧光闪烁现象[33]。2015年,一种新型的量子点——钙钛矿量子点(Perovskite)被成功制备[34]。这种量子点除具有Ⅱ-Ⅵ族量子点高量子产率的优点外,还能够利用简单卤素交换实现可见光区发光性质调节,目前已在LED、量子点激光器、太阳能电池等领域展现出应用潜力[35]。最近研究发现,钙钛矿量子点同样存在荧光闪烁行为[36-37],但亦有研究者发现合成的钙钛矿量子点距离较远时不闪烁,距离靠近时闪烁[38]。

Ⅳ族量子点以硅量子点为代表。硅为间接带隙半导体,而当硅尺寸减小到4 nm的激子波尔半径时,量子限域效应使其声子调控的间接带隙跃迁被抑制,而直接带隙跃迁得到增强,呈现出强的荧光[39]。已有研究表明,硅量子点与Ⅱ-Ⅵ和Ⅲ-Ⅴ族量子点类似,同样具有荧光闪烁行为[40]。

2.2 荧光碳纳米点(石墨烯量子点)

自从2004年被首次发现以来,荧光碳纳米点以其易于制备、低毒和高荧光稳定性受到广泛研究[41]。Sun等[42-44]将激光蚀刻法合成的荧光碳纳米点进行PEG修饰后,利用共聚焦荧光显微镜进行了单颗粒成像,发现其无闪烁现象。然而,Richards等[45]在对合成的荧光碳纳米点进行单颗粒成像时,发现荧光碳纳米点具有闪烁现象,且on态和off态均存在多种荧光强度值,揭示了其多发光中心的特点,显著区别于传统的半导体量子点和钙钛矿量子点。石墨烯量子点属于一类特殊的荧光碳纳米点,严格意义上讲是具有一层或者少数几层石墨烯结构的荧光碳纳米点。Xiao等[46]对石墨烯量子点进行了单颗粒成像并测得了单颗粒光谱,发现了大量颗粒测试时得不到的信息:石墨烯层数越多的颗粒,其荧光越强而寿命越短;石墨烯量子点尺寸分布宽,但具有相同的光谱线宽和发射峰位;石墨烯量子点无闪烁的特征。

2.3 聚合物点

聚合物点是指由∏共轭聚合物组成的荧光纳米颗粒。通常认为尺寸大于10 nm的聚合物点不存在闪烁特征,而小尺寸的聚合物点仍存在闪烁。这是由于较大的聚合物点具有多个发光中心引起强度平均化所致[47]。

2.4 金属纳米簇

当金属的尺寸达1 nm左右时,导体的连续能带将变成分离能级,即量子限域效应将使金属纳米颗粒表现出荧光特征,称为荧光金属簇,目前主要包括银、金和铜簇。一般认为Ag纳米簇不存在荧光闪烁现象,是指其在0.1 ms~1 s的生物学标记窗口中无闪烁[48]。2007年,Dickson等[49]合成了单链DNA修饰的Ag纳米簇(C12-Agn),利用Hg灯激发在宽场下观察到其单纳米颗粒的近红外荧光发射,研究发现647 nm连续波激光器照射下,低功率时C12-Agn未表现出闪烁,而高功率下表现出闪烁(23 000 W/cm2)。金纳米簇通常存在长时间的闪烁。Majima等[50-51]以405 nm二极管激光器作为光源,在显微镜上原位照射自由基前躯体2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和氯金酸的混合物,发现聚乙酸乙烯酯膜上原位产生了无配体修饰的荧光金纳米簇,直径约1 nm,最大激发波长和最大发射波长分别位于409 nm和490 nm,单纳米颗粒成像揭示其存在闪烁特征且长时间处于off态,并利用单颗粒荧光研究了其与氧气的相互作用。

3 单颗粒荧光闪烁的利与弊

虽然量子点的荧光闪烁制约了其在很多方面的应用,但荧光闪烁并非完全不利,这一现象的利与弊取决于其用处[52-54]。从基础研究的角度来说,荧光闪烁现象是中性的。量子点作为荧光探针和单光子源时,荧光闪烁现象会带来负面影响。然而,利用量子点的荧光闪烁可以研究反应活性及电子转移,而超分辨荧光成像正是利用了量子点荧光闪烁的性质。

3.1 荧光闪烁之弊

近年来,量子点发光设备(QD-LEDs)发展迅猛。显示器件在经历了阴极射线管(CRT)的笨重、等离子体面板易烧屏、有机发光二极管(OLED)寿命短的变革后,QD-LEDs展现了独特的优势,具有色彩纯净、饱和度高、色域广、使用寿命长等特性。然而,量子点的荧光闪烁会影响QD-LEDs的发光性能[55],这是由于量子点的荧光闪烁会降低其荧光量子产率,从而直接降低外部量子效率。荧光闪烁对单分子的光电器件影响尤其大,荧光闪烁的off态持续时间可从秒级到数分钟甚至更长,甚至可能导致器件长时间不发光。

相比于有机荧光分子,量子点用作生物探针时具有光稳定性好、亮度高等特点。然而,量子点的荧光闪烁会导致生物体系中单分子追踪的中断,从而要求特殊、复杂的数据分析方法重建单细胞的轨迹[56-57]。

3.2 荧光闪烁之利

由于光学衍射极限的存在,光学显微镜的分辨率受限,在数值孔径为1.4,入射光波长为550 nm的情况下,水平方向和z轴方向分辨率分别为200 nm和500 nm[58]。因此,普通的光学显微镜很难看清细胞结构,所以发展一种高空间分辨率的技术尤为重要。

图3 STORM超分辨荧光成像的原理[17]Fig.3 Schematic of stochastic optical reconstruction microscopy(STORM)with fluorophores[17]

Betzig、Zhuang等[16-17]于2006年几乎同时提出了随机光学重构显微术(STORM)和光活化定位显微术(PALM)。这两种成像技术均是利用荧光漂白和荧光恢复的特性调控活性荧光生色团的密度,通过单分子水平的超定位技术实现超分辨成像,其水平方向和z轴方向分辨率分别能达到20 nm和50 nm。以STORM超分辨荧光成像为例,绿光和红光分别为激发光和成像光源。通过使用低功率的绿光照射样品,使少部分荧光分子发荧光,再将这些发光的分子全部猝灭,然后再随机激活一部分荧光分子。循环往复,直至所有的荧光分子均被猝灭(图3)。这些每次被激发的分子团相距较远互不干扰,经过二维高斯拟合能够精确定位每个荧光分子的中心位置。连续拍摄多张图片,得到所有荧光分子的中心位置,最后叠加构成完整的图像。由此可见,荧光闪烁现象不仅启发了超分辨荧光成像技术的发展,而且构成了一些超分辨技术(如dSTORM)的直接基础。

Lagerholm等[59]测定了DNA片段间的距离,利用量子点的荧光闪烁精确测定相距很近的量子点的位置,由于每个量子点闪烁行为不同,通过连续拍摄一段录像,分析比较图像中每个像素点记录的荧光在这段时间内的闪烁情况。选取某个量子点进行分析,将此量子点在这段时间内的每次定位进行平均,按此方法对所有量子点进行定位。

Jain等[60]研究了有荧光发生变化的离子交换反应,在交换反应发生时由于瑕疵或掺杂,导致量子点荧光闪烁严重,从而可通过荧光闪烁随反应变化的时间反映中间产物的寿命,所研究的离子交换反应如下:

不同于对多个颗粒的荧光轨迹单独分析,此项研究则是分析多个颗粒在同一帧的发光情况求得每刻发光的颗粒数(Bright fraction),从而得到量子点平均闪烁信息。该研究对不同反应方向的Bright fraction随时间变化进行分析,进而由荧光闪烁现象加剧的时间确定中间态寿命。因为在离子交换过程中,电荷不匹配产生捕获位点以及交换不完全引入杂质而产生捕获态,会导致off态变得更加普遍。尽管荧光闪烁具有随机性,但仍然可以建立量子点荧光闪烁行为与其化学/结构状态之间的关系。因此,可以利用量子点荧光闪烁行为指示量子点化学/结构的质量。

半导体量子点的荧光闪烁现象本质上是随机动态的载流子行为在量子效率上的反映。这一行为在引起间歇性的载流子复合过程(即荧光)的同时,可能导致界面上电子或空穴转移(即光化学反应)的不连续性[61]。基于此,本课题组近期利用表面等离激元共振显微镜[62]和荧光显微镜[63]分别测量了单个CdS纳米颗粒在连续光激发下的催化产氢效率,发现了显著的光化学间歇特性。这些结果在单颗粒水平上建立了半导体光物理过程与光化学反应之间的内在关联。

4 总结与展望

本文简要介绍了单颗粒荧光闪烁的现象、机理与应用等方面的研究进展。荧光闪烁现象具有随机性、显著性、频繁性等典型特征,且其在荧光纳米材料中普遍存在。目前,尽管对单颗粒荧光闪烁的光物理机制已有较多认识和理解,但许多细节仍有很大争议。荧光闪烁尚不能被完全消除,只能在一定程度上加以抑制,如何获得不闪烁的量子点仍是许多科学家努力的方向。然而,荧光闪烁并非完全有害无益,它不仅为超分辨荧光成像技术的发展提供了原始的启发,近年来更为半导体异质结、光化学反应和分析传感等领域带来了许多新的潜力和机遇。比如,通过利用荧光闪烁的相关动力学规律作为生物化学传感器的检测信号,有望发展出可用于单细胞等微纳尺度复杂体系的新型单颗粒传感方法。相信随着研究的不断深入,科研工作者们能够调控荧光闪烁,并利用荧光闪烁特性研究单纳米晶更多方面的性质和应用。

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