饲养方式和屠宰季节对乌珠穆沁羊肉肌内结缔组织特性的影响

侯小伟，仁钦索丽，格日勒图，高金龙

（1.乌海职业技术学院化学工程系，内蒙古 乌海 016000；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；3.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310000）

不同部位的动物肌内结缔组织的结构和组成不同，导致不同部位肌肉在烹饪过程中的韧性有很大差异[1-3]。嫩度是消费者评价羊肉食用品质的重要指标之一[4]。Archile-Contreras等[5]研究表明，不同肌肉间肌束膜中胶原蛋白的溶解性与饲养时的营养有关。Torrescano等[6]研究表明，不同肌肉间胶原蛋白的溶解性有差异，背最长肌中胶原蛋白的溶解性大于冈下肌和半膜肌。Archile-Contreras[5]、Cassar-Malek[7]等的研究表明，饲养方式对不同肌内胶原蛋白的溶解性有一定影响。Archile-Contreras等[5]发现牛的生长速率受每日摄入热值高低的影响，高能量的饲养使得背最长肌和半腱肌的胶原蛋白含量降低，也在不同程度上影响胶原蛋白的热溶解性。Modzelewska-Kapituła等[8]研究发现，摄食强度对胶原蛋白含量和冈下肌肌肉的食用品质有一定影响，摄食强度高的牛肉中脂肪含量和可溶性胶原蛋白含量较高。Voutila等[9]利用差示扫描量热法研究猪肉不同部位肌内结缔组织的热变性，认为不同部位肌内结缔组织的热变性不同。Latorre[10]、Lepetit[11]等认为熟肉制品韧性与肌肉胶原蛋白有关，在烹饪过程中，肌束膜网络结构由于受热变得致密，肌原纤维蛋白受热失水，导致胶原蛋白在熟肉中的含量增加，进而导致收缩力变大，剪切力增加。

本研究测定不同饲养方式和屠宰季节的乌珠穆沁羊半腱肌和背最长肌结缔组织内胶原蛋白的含量、胶原蛋白热溶解性、吡啶诺啉含量和结缔组织热变性温度，旨在为改善家畜肉质和提升畜牧业产品加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用冬、夏季屠宰的乌珠穆沁草原自然放牧和锡林浩特毛登牧场圈养的18 月龄健康、膘情中、体态基本相近的去势公羊各6 只。其中屠宰季节夏季为8月，冬季为2月，自然放养公羊为终年放牧，不补饲，只在雪大不能放牧时稍加补草，圈养公羊采用某品牌饲料配方饲喂。

Tris-base、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、对二甲氨基苯甲醛 南京博尔迪生物科技有限公司；L-羟脯氨酸、马来酸、组氨酸、透析袋美国Sigma公司；氯化钙、氯胺T、异丙醇、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钾、硫代硫酸钠、氯化钠 天津市化学试剂三厂；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

XHF-D组织捣碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-10C冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；DSH-300A恒温水浴振荡器 上海雅荣生化设备有限公司；H2500R-2冷冻高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；PG-9140A电热鼓风干燥箱、烘箱 上海一恒科学仪器有限公司；DZ3335差示扫描量热仪 南京大展机电技术研究所；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用有限公司；Agilent 1100 HPLC系统 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

从屠宰96 h后的羊胴体上取下半腱肌和背最长肌，放入冷冻恒温采样箱，实验前将样品于4 ℃条件下解冻，去掉外部的结缔组织（肌外膜）。

1.3.2 结缔组织的分离

参照Fujii等[12]的方法。向100 g肌肉样品中加入250 mL pH 7.2、含有0.1 mol/L KCl和0.01 mol/L Tris-马来酸的缓冲液破碎，再加入250 mL缓冲液搅拌12 h；过滤后在滤渣上加250 mL pH 6.4（0.6 mol/L KCl、0.01 mol/L KH2PO4和Na4P2O4、0.001 mol/L MgCl2）的缓冲液搅拌12 h，离心（3 000×g，30 min）后向沉淀中加250 mL 0.6 mol/L KCl、0.06 mol/L Na2S2O3溶液，搅拌12 h后离心（3 000×g，30 min）；用蒸馏水洗涤沉淀，离心（6 000×g，30 min）后冷冻干燥。

1.3.3 肌内膜和肌束膜的分离

参照Light等[13]的方法。向100 g肌肉样品中加入500 mL 0.05 mol/L CaCl2溶液破碎，过滤，滤液中为粗肌内膜，滤渣为粗肌束膜。滤液在4 ℃条件下静置12 h，向沉淀中加入500 mL pH 7.4含有0.025 mol/L NaCl、0.002 5 mol/L组氨酸、0.005 mol/L Tris-HCl的缓冲溶液，搅拌5 min后离心（3 000×g，20 min）分离；沉淀中依次分别加等量上述缓冲液和pH 7.4的5 mmol/L Tris-HCl缓冲液，静置后离心（3 000×g，20 min）分离；最后沉淀中加入pH 7.4、含有0.1% SDS、5 mmol/L Tris-HCl的缓冲液搅拌后离心（3 000×g，20 min），沉淀在蒸馏水中透析12 h后冷冻干燥。将粗肌束膜在500 mL pH 7.4含有0.1% SDS、5 mmol/L Tris-HCl的缓冲液中静置5 min后离心（3 000×g，20 min），沉淀在蒸馏水中透析12 h，冷冻干燥。

1.3.4 胶原蛋白含量和热溶解性测定

参照Bergman[14]、Hill[15]等的方法。利用分光光度法于558 nm波长处测定样品中羟脯氨酸的含量，加热溶解的胶原蛋白含量为测得的羟脯氨酸含量乘以7.52，不溶性胶原蛋白含量为将沉淀测得羟脯氨酸含量乘以7.25。结缔组织、肌内膜和肌束膜中的胶原蛋白含量即可溶性和不溶性胶原蛋白含量的总和。胶原蛋白的热溶解性按照下式计算。

1.3.5 吡啶诺啉含量测定

向30 mg结缔组织中加入45 mL 6 mol/L HCl水解，于120 ℃条件下放置12 h[16]。水解剩余物水浴蒸发干燥去除HCl，用NaOH中和残留的HCl，真空干燥。测定吡啶诺啉含量前用200 μL 0.5%七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）溶解后，用高效液相色谱仪进行色谱分析[17]。

1.3.6 结缔组织热变性温度测定

在差示扫描量热仪样品坩埚中准确称取30 mg样品，压紧密封，以等量氧化铝做参比，将样品以1 ℃/min的速率从20 ℃加热升温至100 ℃。

1.4 数据处理

利用SAS软件的方差分析模型对不同屠宰季节和饲养条件下同一部位肌肉中结缔组织内胶原蛋白的含量、胶原蛋白热溶解性、吡啶诺啉含量和结缔组织热变性温度的测定数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 乌珠穆沁羊不同部位肌肉中的胶原蛋白含量

表 1 乌珠穆沁羊不同部位肌肉中胶原蛋白的含量Table 1 Collagen content in different muscles from Wuzhumuqin sheep mg/g

由表1可知：半腱肌样品中胶原蛋白的含量高于背最长肌样品；肌内膜中胶原蛋白的含量高于肌束膜；夏季屠宰圈养乌珠穆沁羊的半腱肌和背最长肌中的胶原蛋白含量高于冬季；自然放养乌珠穆沁羊的半腱肌和背最长肌胶原蛋白含量高于圈养。饲养方式对乌珠穆沁羊背最长肌和半腱肌结缔组织、肌内膜样品的胶原蛋白含量影响显著（P＜0.05）；屠宰季节对自然放养、圈养乌珠穆沁羊的半腱肌和自然放养乌珠穆沁羊的背最长肌结缔组织、肌内膜的胶原蛋白含量影响显著（P＜0.05）。这可能是由于乌珠穆沁羊在日常活动过程中，半腱肌的运动强度高于背最长肌，夏季的运动量高于冬季，导致半腱肌样品的胶原蛋白含量高于背最长肌，夏季样品高于冬季；自然放养的运动量远大于圈养，且二者获取营养物质的方式及来源存在差异，饲料喂养的乌珠穆沁羊肌肉内有较高含量的肌原纤维蛋白和脂肪沉积，导致圈养乌珠穆沁羊的胶原蛋白含量低于放养。因此饲养方式和屠宰季节对样品的胶原蛋白含量有较大影响，屠宰季节对放养乌珠穆沁羊的背最长肌胶原蛋白含量影响显著，而对圈养影响不显著，原因可能为放养乌珠穆沁羊的冬夏季间草料的差异，而圈养乌珠穆沁羊的四季均采用相同饲料喂养。

2.2 乌珠穆沁羊不同部位肌肉中胶原蛋白的热溶解性

表 2 乌珠穆沁羊不同部位肌肉中胶原蛋白的热溶解性Table 2 Heat-soluble collagen in different muscles from Wuzhumuqin sheep%

由表2可知：相同饲养条件下，夏季屠宰乌珠穆沁羊的胶原蛋白热溶解性高于冬季，肌内膜胶原蛋白热溶解性最高，肌束膜最低；背最长肌胶原蛋白热溶解性高于半腱肌。同一屠宰季节，圈养乌珠穆沁羊的胶原蛋白溶解性高于自然放养。相同条件下，背最长肌结缔组织和肌束膜中胶原蛋白的溶解性高于半腱肌。饲养条件和屠宰季节对背最长肌结缔组织、肌内膜中胶原蛋白的热溶解性均影响显著（P＜0.05）；半腱肌肌束膜胶原蛋白的热溶解性受屠宰季节的影响不显著。

Archile-Contreras等[5]研究表明，半腱肌的总胶原蛋白含量比背最长肌高，胶原蛋白热溶解性较低，该研究利用玉米、苜蓿和草饲养动物后，测定动物半腱肌和背最长肌中胶原蛋白的含量和热溶解性，结果表明，用草饲养的动物半腱肌中总胶原蛋白含量最高，苜蓿次之，玉米饲养的动物半腱肌中总胶原蛋白含量最低，胶原蛋白热溶解性变化不显著（P＞0.05）。Maltin等[18]研究发现，用青草饲养的动物背最长肌中胶原蛋白含量比用粮食饲养要高，与本研究结果一致。Bailey[1]、Li[19]等的研究表明，半腱肌中总胶原蛋白含量较高、胶原蛋白热溶解性较低的原因可能与运动有关。然而也有其他研究[20-21]认为胶原蛋白含量不受饲养方式的影响。Muir[22]、Purslow[23]等认为，胶原蛋白对肉嫩度的影响既取决于其含量也取决于其热溶解性。Fishell[24]、Wu[25]等研究发现，高能量饲料喂养的牛由于具有较高的生长速率而表现出更快的蛋白质转化率，因此它们的肉中含有较高比例的新合成胶原蛋白，因此具有较高的胶原蛋白热溶性；3 种肌肉结缔组织的热稳定性不同，冈下肌与背最长肌和半腱肌相比有较高热收缩温度和胶原蛋白溶解性，冈下肌胶原蛋白含量最高，背最长肌最低。这也与本研究结果一致。

2.3 乌珠穆沁羊不同部位结缔组织中的吡啶诺啉含量

表 3 乌珠穆沁羊不同部位结缔组织中吡啶诺啉的含量Table 3 Pyridinoline content in connective tissue of different muscles from Wuzhumuqin sheep%

图 1 乌珠穆沁羊结缔组织中吡啶诺啉与可溶解性胶原蛋白的含量Fig. 1 Contents of pyridine and soluble collagen in connective tissue from Wuzhumuqin sheep

由表3可知，饲养方式和屠宰季节对乌珠穆沁羊半腱肌和背最长肌结缔组织中吡啶诺啉的含量均影响显著（P＜0.05），其中自然放养乌珠穆沁羊结缔组织中吡啶诺啉的含量较圈养偏高，冬季屠宰乌珠穆沁羊结缔组织中吡啶诺啉的含量高于夏季，半腱肌中吡啶诺啉含量高于背最长肌。由图1可知，吡啶诺啉含量与胶原蛋白的溶解性成反比。吡啶诺啉是一种成熟的胶原蛋白交联，其溶解性很低[16]。吴琼等[26]发现，动物肌肉内胶原蛋白分子交联的形成与家畜品种、年龄、肌肉部位以及饲养等因素有关。张文等[27]发现，胶原蛋白之间交联程度的大小是影响胶原纤维溶解性的主要因素。以上结论与本研究结果一致。由于胶原蛋白的热溶解性受饲养方式和屠宰季节影响较大，吡啶诺啉含量也受饲养方式和屠宰季节影响显著。Young等[16]发现，在测定胶原蛋白热溶解性时，加热处理并离心时，上清液中没有测出吡啶诺啉，全部保留在沉淀物中，表明所有吡啶诺啉在加热后均保持不溶，因此作者认为吡啶诺啉可以解释部分肌内胶原蛋白的热溶解性，但是与感官和剪切性能关系较小。关于吡啶诺啉含量对肉品质的影响需要进一步研究。

2.4 乌珠穆沁羊不同部位肌肉的热变性温度

表 4 乌珠穆沁羊不同部位肌肉的热变性温度Table 4 Thermal denaturation temperature of different muscles from Wuzhumuqin sheep℃

由表4可知，半腱肌结缔组织、肌内膜和肌束膜的热变性温度均低于背最长肌，相同季节屠宰时，自然放养乌珠穆沁羊肌肉的热变性温度高于圈养。这可能是由于肌内胶原蛋白的变性峰值温度受胶原蛋白与蛋白聚糖相互作用的影响[28]。胶原蛋白和蛋白聚糖对热不稳定，因此受热后它们的特性会发生变化。蛋白多糖的热变性对胶原蛋白的分子力学结构并不能起到直接作用，但它与胶原纤维分子的相互作用决定了胶原蛋白的热稳定性。上述结果表明，在结缔组织加热过程中背最长肌较半腱肌稳定、自然放养较圈养稳定。

3 讨 论

乌珠穆沁羊半腱肌和背最长肌结缔组织的特性受饲养方式和屠宰季节影响较大。夏季屠宰乌珠穆沁羊半腱肌和圈养乌珠穆沁羊的背最长肌中的胶原蛋白含量及其热溶解性高于冬季，而吡啶诺啉含量为冬季高于夏季，其中半腱肌中总胶原蛋白和吡啶诺啉含量较高，胶原蛋白热溶解性和热变性温度较低，背最长肌则相反；自然放养乌珠穆沁羊的半腱肌和背最长肌中胶原蛋白和吡啶诺啉的含量及热变性温度高于圈养，而热溶解性则相反，吡啶诺啉含量与胶原蛋白的溶解性成反比。

饲养方式对乌珠穆沁羊背最长肌中胶原蛋白的含量及其热溶解性和吡啶诺啉含量均影响显著（P＜0.05）；对半腱肌结缔组织、肌内膜中胶原蛋白含量、结缔组织和肌束膜中胶原蛋白的热溶解性及结缔组织的吡啶诺啉含量均影响显著（P＜0.05）。

屠宰季节对乌珠穆沁羊半腱肌中的胶原蛋白含量、结缔组织热变性温度和吡啶诺啉含量均影响显著（P＜0.05）；对背最长肌中胶原蛋白的热溶解性、吡啶诺啉含量和自然放养乌珠穆沁羊的背最长肌结缔组织、肌内膜中胶原蛋白含量影响显著（P＜0.05）。

饲养方式对乌珠穆沁羊背最长肌结缔组织特性的影响大于半腱肌，屠宰季节对圈养乌珠穆沁羊背最长肌结缔组织特性的影响大于圈养。薛宝玲[29]、陈代文[30]等认为，自然放养方式较圈养不仅有助于动物体内营养物质的积累，还可以增加风味物质，如一些不饱和脂肪酸等。本课题组今后将进一步研究饲养方式对肉中营养物质和风味物质的影响。