上调微小RNA-200 a表达对非小细胞肺癌紫杉醇化疗敏感度的影响及其机制

王亚飞，宋小天，宋长亮，张磊，万良刚，杜雪菲

1邯郸市中心医院肿瘤科，河北 邯郸056000

2河北医科大学基础医学院免疫教研室，河北 邯郸056000

3冀中能源峰峰集团有限公司总医院骨科，河北 邯郸056000

在中国，肺癌的发病率和病死率均较高，其中，病死率位居恶性肿瘤的首位。根据组织学特征和临床特点，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占肺癌的85%以上[1]。早期肺癌患者多无自觉症状，大多数患者确诊时已属于晚期，错失了最佳的手术治疗时机，故放疗和化疗是肺癌的主要治疗手段。术后放化疗能够有效减少肺癌的复发和转移，但部分患者常常在一线治疗后对化疗药物表现出较低的化疗敏感度，如何增强化疗药物的敏感度是化疗面临的重要难题。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。紫杉醇是从红豆杉科植物中提取的一种抗肿瘤二萜类化合物，是一种细胞周期特异性药物，在乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的化疗中得到广泛应用，但患者常常出现抗药性和耐药性。如何实现紫杉醇在治疗过程中增敏、增效的作用是临床亟需解决的问题。微小RNA（miroRNA，miRNA）是一类具有组织特异性、高度保守性和时序性等特征的小分子非编码小RNA，在肿瘤基因表达的调控过程中具有重要的作用。miRNA-200家族是miRNA的重要组成部分，是近年来研究的热点。miRNA-200a作为miRNA-200家族中的重要一员，参与肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程[2-4]。有研究发现，miRNA-200a在非小细胞肺癌组织及细胞中低表达，上调其表达后能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等[5-7]。但目前未见关于miRNA-200a是否参与肺癌治疗过程中紫杉醇耐药机制的相关研究，本研究以体外实验的方式采用脂质体法干扰miRNA-200a在非小细胞肺癌细胞中的表达，观察其对非小细胞肺癌细胞紫杉醇化疗敏感性的影响，并探讨其可能的作用机制，为逆转肺癌化疗耐药性提供新的方向和理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人肺上皮16HBE细胞株和人肺癌A549细胞株均购自美国ATCC公司，miRNA-200a模拟物（miRNA-200a mimics）、miRNA-200a阴性对照（mimics NC）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物均购自上海吉玛公司，RNA逆转录试剂盒、荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒和荧光定量PCR仪均购自美国TaKaRa公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、LipofectamineTM2000和电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂均购自美国Invitrogen公司，紫杉醇（纯度99.5%）购自西安天丰生物科技有限公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）检测分析试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和Trizol试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）均购自美国 Sigma公司，β-连环蛋白（β-catenin）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体和辣根过氧化物酶标记的IgG-HRP二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，酶标仪和凝胶成像系统均购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将复苏后的正常人肺上皮16HBE细胞和肺癌A549细胞接种于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI-1640培养基上，置于5%CO2、95%湿度和37℃的恒温培养箱中进行培养，隔1天换液1次，待细胞几乎铺满整个培养瓶时，以0.25%胰蛋白酶进行消化传代。收集对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测采用qRT-PCR法检测miRNA-200a的相对表达量。收集对数生长期的正常人肺上皮16HBE细胞和A549细胞，采用Trizol法提取两种细胞中的总RNA，采用紫外分光光度计检测所提取的总RNA浓度及纯度。采用RNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据miRNA-200a特异性引物、内参U6引物及相应的组分配成20 μl的反应体系（Master mix10 μl、上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl，ddH2O 6.4 μl），以95℃ 5 min（1个循环）、95℃ 30 s（35个循环）、58℃ 30 s（35个循环）、72℃ 2 min（35个循环）和72℃6 min（1个循环）的反应条件进行PCR扩增。以U6为内参。应用2-△△Ct法计算miRNA-200a的相对表达量。实验重复3次。

1.2.3 细胞转染及分组取对数生长期的A549细胞，将其分为空白对照组、mimics NC组和miRNA-200a mimics组，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书的实验步骤将miRNA-200a模拟物和转染试剂混合物转至miRNA-200a mimics组细胞中，miRNA-200a阴性对照和转染试剂混合物转至mimics NC组细胞中，空白对照组中只加入转染试剂。其中，miRNA-200a模拟物和miRNA-200a阴性对照的浓度均为25 μmol/L。转染48 h后，按照1.2.2中的步骤检测各组细胞的转染效果。

1.2.4 MTT法检测收集对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为105/ml，以每孔1 ml接种至96孔细胞培养板上。将其随机分为紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组。其中，miRNA-200a+紫杉醇组细胞先以脂质体法转染miRNA-200a模拟物，紫杉醇组细胞不进行转染，转染6 h后，继续培养24 h。当细胞融合度达到80%左右时，两组细胞分别加入终浓度为2、4、8、16、32 nmol/L的紫杉醇溶液，处理反应24 h后，加入浓度为5 g/L的MTT溶液10 μl，避光孵育4 h后，弃培养液，加入DMSO溶解结晶物后，采用全自动酶标仪于490 nm处检测两组细胞的吸光度值，计算两组细胞相应浓度的细胞增殖抑制率，并计算出半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。其中，每个浓度重复3次。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测取对数生长期的A549细胞，制成细胞悬液后，以105/ml细胞接种至96孔板上，将其随机分为空白对照组、miRNA-200a mimics组、紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组。按照1.2.3中的实验方法转染miRNA-200a模拟物至miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞，空白对照组和紫杉醇组细胞不进行处理，4组细胞继续培养48 h后，以8 nmol/L的紫杉醇处理紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞，处理24 h后，收集各组细胞，以RIPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒检测其纯度及浓度。取变性后的50 μg样品蛋白，注入SDSPAGE凝胶中进行电泳分离，转至PVDF膜上后，置于5%的脱脂奶粉封闭液中处理1 h，加入稀释浓度为1∶1000的β-catenin抗体和GAPDH抗体，4℃下孵育过夜。次日，洗膜后加入稀释浓度为1∶2000的IgG-HRP二抗，于37℃下孵育2 h，以ECL显色。以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-200 a在非小细胞肺癌 A549细胞中的相对表达量

非小细胞肺癌A549细胞中miRNA-200a的相对表达量为（0.26±0.08），明显低于正常人肺上皮16HBE细胞的（1.02±0.03），差异有统计学意义（t=15.407，P＜0.01）。

2.2 转染后 A549细胞中miRNA-200 a的相对表达量

转染48 h后，空白对照组、mimics NC组、miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量分别为（1.06±0.12）、（1.18±0.25）和（5.02±0.16），3组细胞中miRNA-200a的相对表达量比较，差异有统计学意义（F=445.487，P＜0.01）。mimics NC组细胞中miRNA-200a的相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（t=0.795，P＞0.05）；miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=26.239，P＜0.01）。miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量明显高于mimics NC组，差异有统计学意义（t=22.408，P＜0.01）。

2.3 miRNA-200 a对紫杉醇化疗药物敏感度的影响

MTT法检测结果显示，随着紫杉醇浓度的增加，A549细胞受到的增殖抑制作用明显增强，且呈一定的浓度依赖性；与紫杉醇组相比，转染miRNA-200a mimics后，随着紫杉醇浓度的增加，A549细胞受到的增殖抑制作用增强（t=4.279、5.968、4.107、3.801、2.825，P＜ 0.05）。miRNA-200a+紫杉醇组的IC50为5.90 nmol/L，紫杉醇组的IC50为 9.57 nmol/L。（表1）

表1 不同浓度紫杉醇溶液处理后 A549细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

表1 不同浓度紫杉醇溶液处理后 A549细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

注：*与紫杉醇组比较，P＜0.05

组别紫杉醇组miRNA-200a+紫杉醇组紫杉醇浓度（nmol/L）2 18.2±1.4 25.7±2.6*48 23.1±3.0 37.3±2.8*43.8±5.2 58.7±3.5*16 62.4±3.8 75.8±4.9*32 71.2±5.1 84.7±6.2*

2.4 转染联合紫杉醇对Wnt/ β-catenin信号通路相关的 β-catenin蛋白的影响

空白对照组、紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别（0.78±0.03）、（0.62±0.05）、（0.48±0.05）和（0.25±0.04），4组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义（F=73.12，P＜0.01）。与空白对照组相比，紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量均明显降低（t=4.526、8.485、14.991，P＜0.01）；与紫杉醇组相比，miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量明显降低，差异有统计学意义（t=10.465，P＜0.01）。（图1）

图1 转染联合紫杉醇处理后 A549细胞β -catenin蛋白的表达情况

3 讨论

miRNA-200家族通过抑制上皮-间质转化在肿瘤转移的过程中扮演着重要的角色。miRNA-200a是miRNA-200家族的重要成员，在多种肿瘤组织中表达水平较低，以抑癌基因的角色参与肿瘤细胞的增殖、凋亡等生理过程[8]。有研究表明，miRNA-200a还参与多种肿瘤化疗药物的耐药过程，如Liu等[9]研究发现，过表达miRNA-200a可能通过调控与耐药相关的ABC家族基因的表达，增加卵巢肿瘤细胞对紫杉醇的敏感度；沈阿灵等[10]研究发现，上调miRNA-200a表达可逆转大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。目前，关于miRNA-200a对非小细胞肺癌化疗药物敏感度的研究较少，本实验通过脂质体法上调肺癌A549细胞中miRNA-200a的表达后，加入紫杉醇药物进行处理，采用MTT法检测miRNA-200a对紫杉醇处理的A549细胞的增殖抑制情况的影响。结果发现，miRNA-200a+紫杉醇组细胞的IC50为5.90 nmol/L，紫杉醇组的IC50为9.57 nmol/L，表明上调miRNA-200a表达能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度。

Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路，是机体正常生长发育的重要途径。Wnt/β-catenin信号通路的异常表达与非小细胞肺癌细胞增殖、分化及凋亡等过程密切相关[11-13]。β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路调控的核心因子，是Wnt/βcatenin通路激活的重要标志。有研究表明，紫杉醇可调控多种肿瘤细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，如Fu等[14]研究发现，卵巢癌对化疗药物紫杉醇的治疗可产生耐药性，这种耐药性与Wnt/β-catenin信号通路有关，在人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3中，紫杉醇能够诱导β-catenin表达；涂雪松等[15]研究指出紫杉醇可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制人鼻咽癌细胞株HONE1的增殖，并促进其凋亡。侯峰强等[16]研究发现，紫杉醇通过抑制胆管癌QBC939细胞内β-catenin蛋白的表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路中βcatenin蛋白的表达还受miRNA-200a的调控。Su等[17]指出，miRNA-200a通过与β-catenin相互作用，可阻断胃癌SGC790细胞和胶质瘤U251细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。为了进一步探讨过表达miRNA-200a能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物敏感度的作用机制，本研究上调肺癌A549细胞中miRNA-200a的表达后，加入紫杉醇药物进行处理，并采用Western blot检测肺癌A549细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin的表达，结果发现，与空白对照组相比，紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中βcatenin蛋白的相对表达量均有所降低，并且miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量明显低于紫杉醇组（P＜0.01）。结果提示，上调miRNA-200a表达可通过阻断Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度。

总之，本研究通过体外实验证实上调miRNA-200a表达能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度，其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，也提示miRNA-200a可能是提高紫杉醇放疗敏感度的潜在靶点，为治疗非小细胞肺癌提供了新的线索。