东莨菪碱对大鼠强迫游泳行为的影响及其作用靶点

时丹丹 杨 健 张金钮 王 刚

(首都医科大学附属北京安定医院 国家精神心理疾病临床医学研究中心 精神疾病诊断与治疗北京市重点实验室，北京 100088)

抑郁症(major depressive disorder，MDD)是一种具有高致残、高复发和高自杀风险的常见慢性精神疾病。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)[1]最新发布的数据显示，MDD全球患病率约为4.4%，患病人数高达3.22亿，已成为世界范围内的首要致残原因。我国MDD的患病率为4.2%，占总伤残损失健康生命年(years lived with disability,YLD)的7.3%[2]，给社会和家庭造成极大的经济负担，已成为迫切需要解决的重大公共卫生问题。目前抗抑郁药是一线治疗方法，但其总体有效率为60%～70%，且一般需要2～4周才能起效[2-3]，影响患者的依从性，不利于病情的恢复。因此，研发快速起效的抗抑郁药物是临床治疗抑郁症的迫切需要。

近年来，多项临床研究[4-5]证明东莨菪碱(scopolamine)小剂量应用时具有快速抗抑郁效应。东莨菪碱作为毒蕈碱型乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor，M受体)的非选择性拮抗剂，与M受体的5种亚型(M1～M5)均有不同程度的亲和力，但究竟是哪种M受体亚型介导其抗抑郁作用尚不清楚。以往动物研究更多关注M1受体在东莨菪碱抗抑郁效应中的作用，而针对抑郁症患者的研究提示M2受体可能与抑郁症发病更为密切，如抑郁症患者背外侧前额叶皮质的M2结合密度较健康人明显降低[6-7]，并且M2受体编码基因CHRM2多态性与抑郁发病显著相关[8-9]。为明确M2受体是否是东莨菪碱抗抑郁的作用靶点，本研究急性强迫游泳模型，观察不同剂量M2受体选择性拮抗剂(methoctramine，MCT)对大鼠抑郁样行为的影响，并同时探讨介导其抗抑郁作用的可能脑区。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年Sprague Dawley(SD)雄性大鼠82只，鼠龄8周，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0011。正常饮食，实验环境清洁，温度25 ℃，昼夜交替12 h，饲养1周以适应环境，每笼2～3只。本实验通过首都医科大学动物伦理委员会批准(伦理批号：AEEI-2018-017)。

1.2 主要药品及试剂

微量给药套管购自瑞沃德公司；微量进样针购自上海高鸽公司；Scopolamine hydrobromide购自英国Tocris公司(批号：114-49-8)；Methoctramine hydrate(批号：104807-46-7)和Muscimol hydrobromide(批号：18174-72-6)购自美国Sigma公司。

1.3 主要仪器

强迫游泳有机玻璃缸(水深37 cm，桶高50 cm，直径30 cm)购自武汉普百康科技发展有限公司。大鼠强迫游泳分析软件EthoVisionXT10购自荷兰Noduls公司。旷场实验系统(100 cm×100 cm×40 cm，底部为黑色，四周壁为黑色，无盖不透明塑料方箱)购自上海欣软信息科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及处理

1)通过强迫游泳实验明确东莨菪碱的抗抑郁样作用：将14只正常SD大鼠采用数字表法随机分为东莨菪碱组和对照组，每组7只，分别腹腔注射25 μg/kg东莨菪碱或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液，24 h后通过旷场实验和强迫游泳实验评价东莨菪碱对大鼠抑郁样行为的影响。

2)利用γ-氨基丁酸-A(γ-aminobutyric acid-A，GABA-A)受体激动剂蝇蕈醇(Muscimol)沉默内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)神经元以明确东莨菪碱发挥抗抑郁效应的脑区：将14只正常SD大鼠采用数字表法随机分为Muscimol+东莨菪碱组和东莨菪碱组，每组7只，在腹腔注射25 μg/kg东莨菪碱前1 h分别向大鼠mPFC立体定位注射Muscimol 1.25 μg或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液，24 h后进行强迫游泳实验观察东莨菪碱的行为学效应是否被阻断。

3)通过M2受体选择性拮抗剂MCT侧脑室注射以明确M2受体是东莨菪碱抗抑郁的作用靶点：将大鼠分为对照组和MCT组，分3批次分别向大鼠侧脑室注射0.5 μg/ 2 μL(对照组和MCT组各9只)、1 μg/2 μL(对照组7只，MCT组10只)和2 μg/2 μL MCT(对照组9只，MCT组10只)，对照组均给予2 μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液。24 h后利用旷场实验和强迫游泳实验评价大鼠行为学变化。

1.4.2 手术和给药

动物称体质量后，用1%(质量分数)戊巴比妥溶液0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉。根据大脑立体定位图谱将套管埋置于双侧mPFC(前囟前2.8 mm，旁开3.1 mm，深度3.8mm，倾斜30°角)或者侧脑室(前囟后0.9mm，旁开1.5 mm，深度3.5 mm)。大鼠术后休息1周后，通过微量给药系统经套管向双侧mPFC注射Muscimol或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液，向双侧侧脑室注射不同剂量MCT或2 μL 0.9%(质量分数)氯化钠注射液，给药速度均为0.2 μL/min，给药后留针5 min。

1.4.3 旷场实验

用来评定大鼠自发性活动能力。提前将大鼠搬入测试室，使大鼠适应环境至少1 h。将大鼠放入旷场设备中心后，开始记录5 min内大鼠在旷场内总路程，每次实验结束用稀释的乙醇彻底清洁旷场。测试过程采用视频记录仪(上海欣软信息科技有限公司)记录并分析。

1.4.4 强迫游泳实验

用来评价大鼠的绝望行为，是评价大鼠抑郁样行为的重要指标。于正式实验前24 h将测试大鼠放入25 ℃水中，室温25 ℃，大鼠悬浮四肢不能触及桶底，15 min后将大鼠取出、擦干后放回笼中；次日在同样的条件下进行强迫游泳5 min，记录5 min内大鼠静止不动时间(大鼠仅有头部露出水面，身体飘浮在水中，四肢可有微动但不挣扎)，测试过程采用摄影机记录，采用荷兰Noduls公司强迫游泳分析软件分析数据。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 东莨菪碱对急性强迫游泳模型大鼠的行为学效应

腹腔注射25 μg/kg东莨菪碱或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液24 h后，两组大鼠强迫游泳5 min静止不动时间比较，差异有统计学意义(t=2.940，P=0.024)，详见表1。旷场总路程比较，差异无统计学意义(t=-1.152，P=0.272)，详见表2。

GroupNumber of caseImmobility timeCtrl7153.54±98.87Scop741.63±19.12*

*P<0.05vsctrl；Ctrl：control；Scop：scopolamine.

GroupNumber of caseTotal movement distanceCtrl725 313.31±3 498.09Scop727 442.58±3 414.89

Ctrl：control；Scop：scopolamine.

2.2 Muscimol对东莨菪碱处理大鼠的行为学影响

东莨菪碱腹腔注射前1 h向大鼠双侧mPFC分别注射1.25 μg GABA-A受体激动剂Muscimol或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液，Muscimol+东莨菪碱组较东莨菪碱组5 min静止不动时间明显增加(t=-3.360，P=0.006)，详见表3；两组旷场总路程比较，差异无统计学意义(t=-2.003，P=0.068)，详见表4。

Group Number of case Immobility time Scop735.74±26.56Mus+Scop7117.66±58.77*

*P<0.05vsScop，Scop：scopolamine；Mus：Muscimol.

GroupNumber of case Total movement distanceScop 726 806.44±2 153.52Mus+Scop731 272.92±5 493.19

Scop：scopolamine；Mus：Muscimol.

2.3 MCT对急性强迫游泳模型大鼠的行为学效应

向大鼠侧脑室分别注射不同剂量MCT或等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液，观察其对大鼠行为学影响(表5、图1)。与0.9%(质量分数)氯化钠注射液组相比，0.5 μg MCT不影响大鼠强迫游泳不动时间(P>0.05)；1 μg MCT明显降低大鼠不动时间(P<0.01)，但不影响旷场总路程(t=-0.281，P=0.783)(表6)；2 μg MCT则可明显增加影响大鼠不动时间(P<0.05)。

表5 不同剂量MCT对大鼠强迫游泳不动时间的影响Tab.5 Effects of different doses of MCT on the immobility time

Ctrl：control；MCT：methoctramine.

图1 MCT对大鼠强迫游泳不动时间及旷场总路程的影响Fig.1 Effects of MCT on the immobility time and total movement distance

A： effects of 0.5 μg MCT on the immobility time；B：effects of 1 μg MCT on the immobility time；C：effects of 2 μg MCT on the immobility time；D：effects of 1 μg MCT on the total movement distance；*P<0.05；**P<0.01；NS：not significant；Ctrl：control；MCT：methoctramine.

Group Number of case Total movement distanceCtrl 712 796.61±7 662.71MCT 1 μg1013 880.98±7 945.42

Ctrl：control；MCT：Methoctramine.

3 讨论

近年来，东莨菪碱的快速抗抑郁治疗效果已被多项临床研究证实，但其作用机制至今仍不清楚。作为M受体的非选择性拮抗剂，东莨菪碱与M1～M55种M受体亚型均可结合，如能找到介导东莨菪碱抗抑郁作用的具体靶点，将对于研发快速起效抗抑郁药具有重要意义。

本研究结果显示：①腹腔注射东莨菪碱能够减少正常大鼠在强迫游泳实验中的不动时间，表明其具有抗抑郁样的行为学效应；②利用Muscimol沉默mPFC神经元后，东莨菪碱的抗抑郁效应被阻断，证实mPFC可能是其作用脑区；③一定剂量的M2受体选择性拮抗剂也具有明显的抗抑郁样行为学效应，提示M2可能是东莨菪碱抗抑郁的靶点之一。

以往研究[10-11]表明，PFC是与抑郁症发病密切相关的脑区，应激可引起PFC神经元萎缩和突触丢失，从而导致神经元之间功能连接下降。抑郁症患者表现出PFC灰质体积减少以及血流改变。而通过增强PFC突触可塑性可发挥抗抑郁作用，如N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA) 拮抗剂氯胺酮，能够迅速增加PFC细胞外谷氨酸浓度，继而激活雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR) 信号通路增强PFC的突触功能，产生快速抗抑郁作用[12]。Muscimol是GABA-A受体激动剂，通过激活GABA受体可沉默靶区的神经元，本实验通过在腹腔注射东莨菪碱前先在mPFC脑区给予Muscimol，阻断东莨菪碱的作用，证明东莨菪碱抗抑郁作用的主要脑区是mPFC。既往的动物实验[13]也表明，小剂量腹腔注射东莨菪碱可减少动物抑郁样行为，在mPFC脑区提前注射Muscimol沉默神经元后，东莨菪碱的这一效应被阻断，本实验也是进一步验证这一实验结果，提示东莨菪碱的抗抑郁样行为作用可能是通过拮抗mPFC脑区的M受体起效的。

在东莨菪碱的作用靶点研究方面，Witkin等[14]发现敲除M1、M2基因的小鼠再给予东莨菪碱腹腔注射后，东莨菪碱减少强迫游泳不动时间的效应被阻断；M2受体拮抗剂SCH226206腹腔注射后也可改善动物抑郁样行为，且敲除M2受体可导致其行为学效应消失。另一种M2受体拮抗剂Gallamine可减少动物强迫游泳不动时间，并在小剂量情况下此种效应成剂量依赖[15]。这些实验证实了东莨菪碱的抗抑郁作用很有可能由M1、M2受体介导。

本研究发现MCT 1 μg侧脑室给药24 h后可改善大鼠抑郁样行为。以往也有研究[16]显示MCT侧脑室注射12 h后可减少抑郁模型大鼠强迫游泳不动时间，其行为学效应和东莨菪碱相似，其机制与调节PFC和海马的激酶A(protein kinase A，PKA)通路从而增强突触可塑性相关。M2受体在皮质中主要分布于谷氨酸能神经元突触前终扣以及突触后GABA能神经元[17-18]。研究[13-19]显示腹腔注射25 μg/kg或mPFC注射100 pg东莨菪碱可快速改善大鼠强迫游泳实验中的绝望行为，其机制是东莨菪碱能够迅速增加大鼠mPFC神经元胞外的谷氨酸水平，使mPFC的mTOR蛋白及其下游核糖体S6激酶磷酸化水平增加，激活mTORC1信号。结合上述研究结果，笔者推测MCT可能通过拮抗GABA能神经元上的M2受体，减少抑制性神经递质释放，去抑制地引起锥体细胞兴奋性增加，激活mTOR通路，增加突触的发生和提高突触可塑性而起到抗抑郁作用。

与此同时，本研究发现相对高剂量的2 μg MCT能够导致抑郁样行为增加，以往也有研究发现高剂量的东莨菪碱同样能够引发抑郁样行为，其机制是通过提高乙酰胆碱酯酶活性，降低环磷腺苷效应元件结合蛋白、细胞外调节蛋白激酶、蛋白激酶B的磷酸化水平[20-21]，继而降低海马和PFC的脑源性神经营养因子和神经肽而引发动物抑郁样行为[22]。高剂量的MCT在导致抑郁方面可能也涉及相似的机制，因此，对M2受体阻断的程度不同可能产生不同的行为学作用。

有研究[23]显示M2受体激动剂carbachol和physostigmine在高剂量时引起动物抑郁样行为增加，而低剂量时减少抑郁样行为，这些实验表明M2受体的激动或抑制均与动物抑郁样行为表现有关，而且与作用其受体的药物剂量也相关。由此可见，M2受体与抑郁症及抗抑郁治疗的关系非常复杂，值得深入研究。本研究不足之处在于只观察了东莨菪碱和M2受体拮抗剂对大鼠抑郁样行为的影响的基本现象，其相关机制研究有待进一步开展，另外，其他M受体亚型在东莨菪碱抗抑郁中的作用也需要进一步探讨。但本次实验结果对于快速抗抑郁药的研发具有指导意义。