噬菌体与宿主细菌的攻防机制

张庆 商延 朱见深 刘晓文 宋胜敏 柳林 由佳 朱应民 齐静 李璐璐 胡明 戴美学 刘玉庆

摘要：噬菌体是侵袭细菌的病毒，也是病毒中最普遍、分布最广的类群。为了防止噬菌体侵染，细菌进化出多种多样的防御机制；而为了突破这些防御机制，噬菌体也进化得到了相对应的反制策略。本文即综述了这一领域的研究进展，有助于理解噬菌体与宿主细菌的共存共进化机制，合理利用噬菌体。

关键词：噬菌体；细菌宿主；防御机制；反防御机制

中图分类号：S852.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）07-0048-07

Abstract Bacteriophage， the virus of bacteria， is the worlds largest and most abundant organism of virus. On one hand， bacteria have developed various defense mechanisms to prevent phage infection， and on the other hand， phages have also evolved corresponding countermeasures to break through these defense mechanisms. In this paper，the research progress in this field was reviewed to understand the co-evolution mechanism between phage and host bacteria， so as to facilitate the rational use of phage.

Keywords Phage； Host bacteria； Defense mechanism； Anti-defense mechanism

Twort[1]与d′Hérelle[2]分别于1915年和1917年独立发现噬菌体。噬菌体治疗的早期结果给人很大希望，但后来因为不良的对照试验以及前后矛盾的结果，有关其治疗细菌感染的功效与再现性引起了巨大争论。而1928年青霉素以及随后各类抗生素的相继发现和应用，使得噬菌体研究基本中断。近年来随着细菌抗药性的不断升高以及多重耐药菌的出现[3]，噬菌体作为一种并行不悖的抗菌剂重新展现了它的潜力。

噬菌体与宿主在自然界形成了共进化平衡。不论是在食品生产领域还是为了明确噬菌体治疗策略，亦或是着眼于噬菌体在环境变化进程中所起到的必要作用，都需要我们深入地研究噬菌体与细菌相互作用的机制。本文综述了吸附阻断、限制修饰系统、CRISPR-Cas系统、流产性感染等细菌的抗病毒策略以及噬菌体用来对抗或者规避这些策略的反制策略。

1 宿主抵抗噬菌体的防御机制

裂解性噬菌体侵染宿主的周期包括吸附、侵入、增殖、成熟与裂解释放五个阶段。为了从噬菌体的感染中存活下来，宿主菌必须在噬菌体颗粒成熟释放之前采取策略遏制噬菌体的传播和增殖，因此针对吸附、侵入、增殖这几个步骤细菌发展出了多种多样的防御机制。

1.1 阻断吸附

噬菌体侵染细菌的第一步即噬菌体吸附到细菌表面，众所周知噬菌体具有高度专一性，只特异性裂解一种或一类细菌，在噬菌体识别并吸附到特定宿主细胞表面这一过程中，噬菌体受体起着至关重要的作用。在长期的共进化过程中，细菌已进化出纷繁复杂的细胞表面结构来从源头阻断噬菌体的侵入。目前这一吸附阻断机制主要可划分为三类，即受体的阻塞、细胞外基质的覆盖以及竞争性抑制剂的竞争抑制。

1.1.1 阻塞受体 细菌可以通过改变其细胞表面受体的结构来阻碍噬菌体的识别。例如可以感染大肠杆菌的T5噬菌体在大肠杆菌表面的受体为FhuA（ferrichrome-iron receptor），可以为一种LIp蛋白（lipoprotein）所阻断，而有趣的是这一蛋白是由T5噬菌体自身基因所编码的[4]。在侵入的初始阶段表达的LIp蛋白可以防止重复感染，并且可以结合到已被裂解细胞的游离受体上防止新合成的病毒颗粒的無效结合，从而提高感染效率[5]。类似的机制还存在于噬菌体BF23中[6]。在许多T偶数噬菌体中，外膜蛋白A（OmpA）是噬菌体的受体，其构象可以被另一种由F质粒编码的外膜脂蛋白TraT修饰从而失去受体活性[7]。又如在金黄色葡萄球菌中，结合在细菌表面的蛋白A可能通过覆盖噬菌体受体的位点来抑制相应噬菌体的吸附[8]。

1.1.2 细胞外基质的覆盖作用 细胞外基质是包绕在细胞外的一层复杂且动态的结构，其成分多种多样，包含有胶原蛋白、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及其他几种糖蛋白类。这些成分都含有相互作用位点以及与细胞膜、细胞表面受体结合的位点，以使得整个胞外基质成为一个整体[9]。而噬菌体识别吸附的受体也被包埋在其中，因此细胞外基质构成了一道噬菌体侵染细菌细胞的物理屏障。

1.1.3 竞争性抑制剂 竞争性抑制剂是一类自然存在于环境中的分子，具有特异性结合噬菌体受体的特性。例如大肠杆菌的B12/BF23受体，既可以协助维生素B12的转运和作为大肠杆菌素的受体，又可以作为噬菌体BF23的受体。当维生素B12的浓度在0.5～2.0 nmol/L时，BF23的吸附效率被抑制50%，同时BF23也可以抑制维生素B12的转运[10]。又如FhuA门控回路作为噬菌体T1、T5和φ80的特异性结合靶点[11]，可以被抗菌肽MccJ25（小菌素J25）结合从而抑制噬菌体的吸附。

1.2 阻断DNA侵入

细菌主要利用超感染免疫（superinfection exclusion， Sie）[12]系统阻止噬菌体DNA的侵入。超感染免疫是宿主菌被一种噬菌体感染后，当另一种类似噬菌体吸附于该宿主细胞表面时，一些可能锚定到膜上或与膜上元件关联的蛋白质就会发挥作用，从而阻止相似噬菌体引起的继发感染（secondary infection）[13]。由此不难看出，竞争性抑制剂在噬菌体-噬菌体相互作用中的意义可能要大于在噬菌体-宿主的相互作用中，也有研究发现，编码竞争性抑制剂的基因经常出现于前噬菌体中，意味着该基因可能是从已经侵入过宿主菌的噬菌体中获得。

以研究较为透彻的大肠杆菌T4为例，存在两种超感染免疫系统——Imm[14]和Sp[15]。编码Imm蛋白的基因位于T4噬菌体DNA代谢相关的基因簇中，Imm蛋白不能独立发挥作用，而是通过结合到噬菌体DNA注入位点的元件上改变其构象来发挥作用[16]。而Sp可以抑制T4噬菌体上蛋白质5的溶菌酶活性，该蛋白质位于尾丝底座上，可能通过酶促降解细胞周质层产生穿孔使得尾管穿过细胞质膜[17]。另外，能感染肠杆菌及相关革兰氏阴性菌的P1噬菌体中也存在超感染免疫sim基因[18]，携带溶原性噬菌体P22的鼠伤寒沙门氏菌的超感染免疫系统SieA可以防止噬菌体L、MG178的感染[19]。

除上述革兰氏阴性菌外，在少数革兰氏阳性菌中也发现了类似的机制，以乳酸乳球菌与嗜热链球菌为例。乳酸乳球菌是一类乳品行业中广泛应用的细菌，由噬菌体污染所造成的损失使人们越来越关注噬菌体防护的研究。该类菌中的超感染免疫系统（Sie2009）首先发现于一种归属于P335型的温和噬菌体Tuc2009中，研究推测该类系统可能广泛分布于乳球菌属中[20]，而之后在乳球菌属中也的确陆续发现了类似的阻断机制[21]。嗜热链球菌中发现的类似系统为温和噬菌体TP-J34编码，产物蛋白Ltp可能干扰噬菌体DNA从头部注射進细胞的过程[22]。近年也在其他的嗜热链球菌温和噬菌体中发现了Ltp类蛋白，如TP-EW、TP-DSM20617和TP-778[23]。

1.3 切割侵入核酸

1.3.1 限制修饰系统 限制修饰系统（R-M system）是目前研究得最深入的噬菌体抗性机制，存在于超过90%的细菌与古细菌中[24]，主要分为四种类型Ⅰ～Ⅳ。该系统主要由甲基转移酶与限制性核酸内切酶配合发挥作用：甲基转移酶负责修饰自源核酸，未被修饰的以及外源侵入的DNA则被限制酶酶切裂解。细菌宿主利用该系统抵御噬菌体侵入也较为广泛，例如单核细胞增多性李斯特氏菌[25]、大肠杆菌[26，27]、乳酸乳球菌[28，29]、弧菌的整合性接合元件中[30]、沙门氏菌[31，32]等等都含有该系统。

1.3.2 CRISPR-Cas系统 成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）及其相关基因Cas （CRISPR-associated）于1987年被发现[33]，并在2005年被确定是一种细菌防御外源核酸的免疫系统[34，35]。当被噬菌体感染后，CRISPR基因座重复间隔区的5′端会增加一段与侵染噬菌体完全同源的序列，当同种噬菌体再次感染时，细菌就会对其产生抗性。近年来，在越来越多的细菌中发现了该系统。

1.4 流产性感染

流产性感染/顿挫感染（abortive infection， Abi）系统会导致被感染的细胞死亡，常不产生成熟的病毒颗粒。尽管对该系统的研究已有几十年，但因为Abi系统的复杂多样性，我们对其作用方式仍然不尽了解，可以总结出的共性是Abi蛋白都是一些休眠蛋白，并会在噬菌体侵入后被活化，引起细胞水平的抑制并且干扰一些必要的代谢过程。以革兰氏阳性菌中的乳酸乳球菌为例，目前已发现的Abi系统就有20余种[36]，这些几乎都是由质粒编码，其作用方式不尽相同，蛋白质同源性也很少。

革兰氏阴性菌中的Abi系统，以大肠杆菌为例，首先被发现的是RexA/RexB系统[37]：当噬菌体侵入细胞，复制与重组的中间产物——一种蛋白质-DNA复合物使得RexA活化，两个RexA激活RexB，RexB在膜上形成离子通道导致膜电位去极化、胞内ATP减少，最终导致细胞死亡。其他研究比较广泛的还有诸如Lit和PrrC系统，Lit系统通过切割翻译延长因子Tu导致蛋白质合成中断，而PrrC蛋白则是切割tRNALys的反密码环，两者都作用于翻译环节[37]。

毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system， TA）是一种细菌内质粒维持自身稳定的系统。这类系统包含两类蛋白——毒素蛋白和抗毒素蛋白，抗毒素蛋白不稳定。当细胞分裂后，抗毒素被降解，毒素就会杀死细胞，只有当编码抗毒素的质粒存在于子细胞中时才能保持细胞生存[38]。近来发现该类系统中的一部分还与Abi有关[39]，即噬菌体入侵后会启动TA系统导致宿主细胞自杀，感染流产。

2 噬菌体抵抗宿主防御机制

虽然宿主细菌有多种防御噬菌体的策略，但仍有很大比例的细菌被噬菌体裂解，这得益于噬菌体进化出的各种对抗细菌防御的方式。

2.1 对抗吸附阻碍

针对受体结构被改变，部分噬菌体进化出了一种被称作多样性引发逆转录因子（diversity-generating retroelements DGRs）的遗传元件，该元件在依赖模板的逆转录酶介导的作用过程下可以在噬菌体基因mtd （major tropism determinant）中引入核苷酸置换，该基因编码的蛋白质负责宿主的识别，因而可以改变或者拓宽噬菌体的宿主谱[40，41]。近年研究发现这一元件广泛分布在细菌基因组（前噬菌体）及其他噬菌体基因组中[42]。此外，还有许多噬菌体通过改变受体结合蛋白或者尾丝结构来识别新的宿主表面受体。例如，噬菌体λ通过改变受体结合相关蛋白J的末端结构域使得其自身不仅可以识别原来的受体LamB，也可以识别宿主变异后的受体OmpF[43]。

针对宿主表面受体被覆盖的情况，噬菌体可以借助酶来裂解胞外的物理屏障，暴露出被包埋的受体。例如，裂解酶和水解酶都可以降解胞外多糖[44，45]，这些酶有的绑定到受体结合蛋白上，也有的可以游离存在。此外，链球菌属的烈性与温和噬菌体含有的透明质酸酶可以降解胞外荚膜的透明质酸成分[46]。

一项最近的研究还发现，噬菌体抗性菌在与敏感型细胞联合培养时会偶尔发生被噬菌体裂解的现象。研究人员称其为获得性敏感（ASEN），解释该现象是由抗性细胞瞬时获得了附近敏感型细胞表面的噬菌体附着分子造成的，并证明这一交换是由膜性小泡驱动的[47]。

2.2 對抗R-M系统

首先，R-M系统切割噬菌体DNA的效率与病毒基因组中的限制性位点是成比例的，因此通过减少或改变限制性位点噬菌体可以有效地规避R-M系统。例如EcoRⅡ限制位点[5′-CC（A/T）GG]需要至少两个才能激发R-M系统的活性，而且对这两个位点之间的距离有一定的要求[48]；而噬菌体T3和T7中的位点相距太远致使R-M系统不能对其进行切割。对于噬菌体基因组的修饰，例如大肠杆菌噬菌体Mu基因组的腺嘌呤可以被Mom修饰为N6-（1-乙酰）-腺嘌呤从而躲过R-M系统[49]；类似的还有一些枯草芽孢杆菌的噬菌体将自身的胸腺嘧啶替换为尿嘧啶或者羟甲基尿嘧啶，更多修饰类型详见文献[50]。另外识别位点序列在DNA双链上的取向也会影响R-M系统的识别[51]。

噬菌体还可以将识别位点保护起来以逃避R-M系统的识别。如噬菌体P1，蛋白质DarA和DarB会同DNA一起注入宿主细胞中，两种蛋白结合到噬菌体DNA上使得Ⅰ类R-M系统的识别位点被覆盖[52]。

另有一些噬菌体可以直接作用于R-M系统使其酶活改变。例如λ噬菌体编码的一种抗限制性酶切蛋白Ral可以增强Ⅰ类R-M系统中修饰酶的活性，使得DNA注入细胞后被迅速大量修饰，减轻限制性内切酶的作用[53]。在Ⅰ类与Ⅲ类R-M系统中，其酶发挥活性需要一种辅因子S-腺苷甲硫氨酸，而噬菌体T3可以在侵染后快速产生一种S-腺苷甲硫氨酸水解酶水解该辅因子使得R-M系统被抑制，值得注意的是，该水解酶不会对已经与辅因子结合的R-M酶产生影响而只是阻止新合成的R-M酶与其辅因子结合[54]。

2.3 对抗CRISPR-Cas系统

噬菌体对于CRISPR-Cas系统的反制措施，主要包括点突变或者核苷酸删除。替换或删除的位置可以是在前间区，也可以在前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif， PAM）中[55]。但是近来一项对于大肠杆菌CRISPR-Cas亚型的研究发现，只有当突变发生在紧邻PAM前间区序列中一段只有七个核苷酸的种子区时，噬菌体才能逃过CRISPR-Cas的免疫作用[56]。

CRISPR-Cas系统存在于48%的细菌与95%的古细菌中[57]，而点突变频率很低，那么是什么原因使得噬菌体在如此普遍又有效的系统下还能增殖扩散的呢？近来一项研究给出了一个可能的答案。该研究在感染铜绿假单胞菌的噬菌体中发现了五种抗CRISPR基因（anti-CRISPR genes），这类基因编码的蛋白质不影响CRISPR小RNA （small CRISPR RNAs， crRNAs）以及Cas蛋白的形成，而是在crRNA-Cas复合物形成后发挥作用[58]。

2.4 对抗流产性感染系统

同抵抗CRISPR-Cas系统类似，噬菌体也可以通过基因突变来抗衡Abi系统。例如，噬菌体T4rⅡ中基因motA的突变可以使其逃过宿主Rex系统的清除[59，60]。又如噬菌体T4的gol变异株可以使Lit蛋白不被激活从而躲过Lit流产性感染系统[61]。在广泛发现Abi系统的乳酸乳球菌中，突变导致的Abi抗性也普遍存在[62，63]。

在TA系统介导的噬菌体Abi表型中也存在规避机制。噬菌体可以自身编码一种抗毒素来中和细胞内的毒素，不使宿主细胞死亡。例如T4噬菌体的Dmd蛋白[64]、黑胫病菌噬菌体φTE编码的伪ToxⅠ蛋白[65]等等。

3 展望

噬菌体与细菌在亿万年的共进化过程中彼此都进化出了多种多样的反制策略，而这也不断丰富着它们的遗传多样性。通过水平基因传递和突变等方式，噬菌体与细菌不断更新着自身的遗传元件。两者作为自然界中最为丰富的微生物，可以说在世界上任何一个角落都同时存在着它们的身影，也不断发生着此消彼长的生存竞争。

得益于测序技术的进步与分子生物学的发展，迄今为止我们已发现的诸多细菌的抗病毒策略以及噬菌体的反制策略，大多基于双链DNA病毒。而自然界中还存在着许多针对单链DNA、双链RNA、单链RNA噬菌体的细菌防御系统以及这些噬菌体用来躲避这些防御系统的策略，等待着我们去发现。而在已经发现的多种策略中，也有很多分子机制我们尚不明确。

在实验室中研究噬菌体-细菌共进化，通常是一对一地进行。而自然状态下，噬菌体与细菌必然是多种多样的群落混杂在一起，在此情况下，细菌针对一种噬菌体可能会采取多种防御策略联合抵抗，反之亦然。因此，模拟自然环境下噬菌体-细菌相互作用的实验应该尽快展开。随着全球范围内对噬菌体研究的重新兴起，我们期望有一天能够利用噬菌体来控制或改造自身及生态环境中其他微生物的群落结构。

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