提高牛、羊胚胎冷冻保存效果的措施

佟桂芝 宋斌 董正德 李信涛 王伟霞 李乃顺

摘要：胚胎冷冻保存是胚胎生物技术的一个重要环节。在质量型畜牧业发展中起着非常关键的作用。而我国牛、羊体内（外）胚胎冷冻效果还没有达到人们预期的水平，从而限制了胚胎移植技术的商业化推广应用。需要突破的技术瓶颈问题是胚胎冷冻、解冻过程中受到机械损伤以及保护剂毒性影响。因此在胚胎冷冻保存中各种抗冻保护剂及冷冻方法要相互结合，取长补短，针对不同发育阶段胚胎而筛选合适的冷冻保护剂及冷冻保存方法，同时简化冷冻一解冻程序，我们应寻找无需昂贵的冷冻设备、操作时间短、易推广的方法。对于胚胎冷冻胚胎移植流产率高、妊娠率及产仔率低等现象还需进一步研究。植物抗冻蛋白在猪胚胎玻璃化保存上的成功应用，使得此项技术能在畜牧业生产中得到广泛的应用，研究内容的意义较大。

关键词：牛；羊；胚胎；冷冻；保存；效果

中图分类号：S852.1

文献标识码：A

文章编号：2095-9737（2018）07-0011-01

1 筛选质量优级胚胎进行冷冻保存

冷冻前羊胚胎的内细胞团的质量不高，细胞碎片多，会使每个卵裂球的完整程度差，细胞脱水与冷冻保护剂渗透到细胞过程的平衡遭到破坏。所以，掌握冷冻前根据胚胎日龄进行羊胚胎质量分级技术是关键技术之一。胚胎细胞形态是影响冷冻胚胎质量的关键因素，是直接影响移植后胚胎存活率及妊娠率的重要因素。

2 胚胎不同发育阶段

胚胎冷冻能否存活的关键在于细胞脱水和保护剂渗透到细胞的过程是否达到平衡。用于冷冻保存的牛、羊胚胎是体内（外）受精六七天，处于桑椹、囊胚、扩张囊胚阶段胚胎。处于不同发育阶段的胚胎形态、细胞数量及特性均有所不同，对冷冻及解冻过程中的机械损伤及保护剂毒性的耐受能力不同。囊胚和扩张囊胚细胞数比桑椹胚的体积小而细胞数多。桑椹胚的细胞数少而体积大，胚胎细胞充分脱水难而且慢，胚胎冷冻、解冻后活力低，移植妊娠率和产仔率低。研究表明，甘油冷冻剂冷冻牛、羊胚胎，采用常规慢速冷冻法时，囊胚、扩张囊胚解冻后移植受胎率，产仔率均明显高于桑椹胚；囊胚和扩张囊胚之间差异不显著。表明甘油冷冻剂更适合冷冻处于囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎。对于桑椹胚：由于乙二醇冷冻保护剂的分子量小，可以快速渗入胚胎细胞，冷冻胚胎的卵裂球保持了高度的一致性，外部形态特征没有任何的变化；甘油的分子量较大，作为胚胎冷冻保护剂时，桑椹胚卵裂球所处位置与卵裂球受保护程度有关，桑椹胚卵裂球位于桑椹胚外部的形态保存正常完整，而卵裂球位于桑椹胚内部的容易被破坏。所以，对于牛、羊不同发育阶段的胚胎建议采用不同的冷冻保护剂进行冷冻保存，处于囊胚、扩张囊胚阶段的胚胎宜采用乙二醇作冷冻剂，桑椹胚宜采用甘油作为胚胎冷冻保护剂效果会更好。

3 胚胎的冷冻方法

胚胎冷冻、解冻时，必须经过冷冻、解冻过程，此时的危险温区是15℃～- 50℃。如果操作不当、冷冻保护剂选择不当或冷冻方法不当，均能在胚胎内形成的大冰晶，对胚胎细胞造成机械性破坏，损伤蛋白质的硫氢键，发生胚胎死亡。因此常规的低温冷冻法就是：在冷冻牛、羊胚胎时，筛选几种低毒的保护剂进行搭配使用，采用合适的降温措施，使胚胎细胞内达到玻璃化状态时，使其能在超低温条件下长期保存。目前已在世界范围内进行人及哺乳动物胚胎的冷冻保存应用。常规慢速冷冻法的优点是解冻后胚胎的存活率较高，适合规模化胚胎冷冻，但这种方法胚胎冷冻程序较繁琐、费时，成本高。玻璃化冷冻（ Vitrification）不需要昂贵的程序降温仪，因此进行牛、羊胚胎冷冻保存的成本低廉。细胞外液不生成冰晶，避免了物理性的机械损伤对胚胎细胞造成的死亡，操作简单。通过筛选毒性更小、渗透性更强的胚胎冷冻保护剂组合，将多种不同类型胚胎冷冻保护剂配合使用，以降低每种保护剂特有的毒性。采取冷冻剂的浓度逐步添加，当添加最终的高浓度保护剂时，在30 s内将胚胎投入液氮中等措施，从而大大降低了冷冻保护剂的毒性，提高了冷冻胚胎的冻后活力。

3.1 常规慢速冷冻法

将卵母细胞或胚胎放入低浓度抗冻剂的冷冻保护液中，经过2 min平衡、诱发结冰8 min后，以0.3—0.5℃/min的速率缓慢降温35℃，停留10 min后投入液氮中进行长期保存。从而使牛、羊胚胎细胞内形成玻璃化状态，卵母细胞或胚胎得以长期保存。目前，常规慢速冷冻法为大多数动物及人类胚胎学家所广泛接受。这种方法在国外已经实现了商业化应用，适合大量的冷冻胚胎，但其主要缺点是冷冻程序较繁琐、费时，必须有昂贵的程序冷冻仪；而且冷冻牛、羊卵母细胞及体外胚胎时效果差。由于需要人工诱发结冰，然后以缓慢的降温速率进行降温，这种胚胎冷冻保存方法虽然可靠，但需要专业的胚胎冷冻仪设备，并且操作程序复杂，时间较长。且必须由专业技术人员操作，专用脱除抗冻剂的解冻液、体视显微镜和实验室无菌条件，不利于在现场条件下进行操作。因此制约了牛、羊胚胎移植技术的推广应用和胚胎生物技术的产业化进程。

3.2 玻璃化保存法

长时间以来，牛羊、胚胎玻璃化保存存在颇多争议，研究证明，在各种冷冻方法中，牛、羊等哺乳动物胚胎玻璃化保存是一种有效、实用的方法。经过近20年研究，发明多种牛、羊体外胚胎玻璃化保存液（解冻液）和保存方法，效果明显优于常规冷冻法，但一直难于走出实验研究阶段，使其真正在生产中得到商业化应用。玻璃化保存技术不需要昂贵的冷冻设备、操作程序简单、省时，与传统胚胎冷冻方法相比具有明显优势，有利于加速良种牛、羊的快速扩繁及品种改良进程，缩短世代间隔。

玻璃化冷冻前，胚胎在玻璃化液平衡过程中，环境温度很重要。室内温度高时，平衡时间短成活率高：温度太低时，平衡时间短并不能使存活率升高。因为在玻璃化液中，乙二醇的渗透量起到关键作用。乙二醇的渗透量与环境温度和平衡时间有关。室温时、乙二醇进入细胞速度快，细胞膜通透性好，需要的平衡时间短。较高温度下经过一个短时间处理是合适的，一般室温为20℃或25℃。而在胚胎解冻过程中，环境的温度同样是很关键的因素之一。太高和太低对解冻胚胎的存活力都是不利的，不利于抗冻剂的脱出及胚胎的复水，室温最好控制在30℃。

牛冷冻胚胎直接移植法可以避免胚胎解冻过程中，脱除冷冻剂过程所带来的形态学检查不精确、操作技术水平的误差等问题，操作省时、简便，不需要任何专门的设备，胚胎解冻直接移植。牛、羊胚胎冷冻后直接移植的方法能降低应用胚胎移植配套技术推广的费用，提高妊娠率及产仔率，促进了牛、羊胚胎冷冻生产商业化进程，加速了品种改良。

4 冷冻保护剂

应用常规冷冻保存法，在羊胚胎冷冻的过程中，甘油作冷冻保护剂，胚胎放人甘油冷冻剂中与胚胎放人乙二醇冷冻剂中的形态变化行為是不同的。乙二醇分子量小，渗入胚胎内速度快，在显微镜下几乎观察不到胚胎形态的变化；甘油分子量较大，甘油渗入胚胎的速度慢，胚胎放入甘油冷冻剂中时，胚胎上浮，胚胎皱缩变小，严重脱水，随着甘油的逐渐渗入，胚胎细胞内、外渗透压达到平衡，胚胎才恢复原来的形状，胚胎下沉至培养皿底。研究证明：牛、羊冷冻胚胎的移植受胎率，甘油和乙二醇作冷冻保护剂的受胎率并没有显著差异，甘油冷冻剂组的移植受胎率略好于乙二醇作冷冻保护剂组，二者作为胚胎冷冻保护剂均是可行的。羊胚胎冷冻，甘油作冷冻保护剂可以作为首选，因为羊的冷冻胚胎进行移植时，需要进行前装管的处理过程；牛胚胎冷冻，可以首选乙二醇作冷冻保护剂，因为牛冷冻胚胎移植时，不需要重新装管的前处理过程，而是可以采用直接移植法。

总之，在胚胎的冷冻、解冻过程中，探寻最佳的冷冻保护剂组合、解冻后一步法脱出冷冻保护剂或者直接移植法，保证胚胎冻后的存活力，提高冷冻胚胎移植受胎率和产仔率，建立简便、快捷的胚胎冷冻解冻移植程序，加速推广家畜良种化进程，胚胎移植配套技术为牛、羊良种化提供技术保障。