肌细胞增强因子2D影响肝癌细胞对索拉菲尼耐药的机制研究

马清霞 王园园 马海龙 李培宇 杨月成 杨志宏 刘佳 姜国辉

中圖分类号 R735.7 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）17-2337-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.08

摘 要 目的：研究肌细胞增强因子2D（MEF2D）影响肝癌细胞PLC对索拉菲尼耐药的作用机制。方法：建立索拉菲尼肝癌耐药细胞株（PLC-DR3），以过表达Ad-MEF2D载体感染PLC（PLC-AdMEF2D），CCK-8法检测索拉菲尼处理后PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D增殖能力，并计算索拉菲尼对各细胞的半数抑制浓度（IC50）。采用Western blot法检测PLC、PLC-DR3中MEF2D、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）的表达和PLC-AdMEF2D细胞中MEF2D、ERK、p-ERK、促分裂原活化蛋白激酶（MEK）、磷酸化MEK（p-MEK）、快速发育生长因子同源蛋白4（SPRY4）的表达。采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA和SPRY4 mRNA的表达。结果：索拉菲尼对PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50分别为（8.23±0.06）、（21.80±0.06）、（19.46±0.063） ?mol/L。与PLC比较，PLC-DR3、PLC-AdMEF2D的IC50明显升高（P<0.001）；PLC-DR3中总ERK表达量基本不变，MEF2D、p-ERK的蛋白表达明显增强（P<0.001）；PLC-AdMEF2D中总ERK、MEK表达量基本不变，p-ERK和p-MEK蛋白表达增强（P<0.01），SPRY4蛋白表达明显减弱（P<0.001），SPRY4 mRNA表达水平明显减弱（P<0.001）。结论：MEF2D可能通过抑制SPRY4的表达，激活RAS/ERK通路，从而促进肝癌细胞对索拉菲尼耐药。

关键词 索拉菲尼；肝癌细胞；耐药机制；肌细胞增强因子2D

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the mechanism of myocyte enhancer factor 2D （MEF2D） affecting the resistance of hepatoma carcinoma cells PLC to sorafenib. METHODS： The liver cancer drug resistance cell strain （PLC-DR3） of sorafenib were established， over expression Ad-MEF2D carrier infected liver cancer cell PLC （PLC-AdMEF2D） and CCK-8 assay was used to determine the proliferation of PLC， PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D， and the half inhibitory concentration （IC50） of sorafenib on each cell was calculated. Western blot assay was used to detect the protein expression of MEF2D， ERK and p-ERK in PLC and PLC-DR3， the protein expression of MEF2D， ERK， p-ERK， MEK， p-MEK and SPRY4 in PLC-AdMEF2D. RT-PCR was adopted to detect the mRNA expression of MEF2D and SPRY4 in PLC and PLC-AdMEF2D. RESULTS： IC50 of sorafenib on PLC， PLC-DR3， PLC-AdMEF2D was （8.23±0.06），（21.80±0.06），（19.46±0.063） ?mol/L. Compared with PLC， the IC50 of PLC-DR3 and PLC-AdMEF2D was increased significantly （P<0.001）； the total expression of ERK in PLC-DR3 keep stale， while the protein expression of MEF2D and p-ERK was increased significantly （P<0.001）； total expression of ERK and MEK in PLC-AdMEF2D kept stable， but the protein expression of p-ERK and p-MEK were increased significantly （P<0.01）， the protein expression of SPRY4 was decreased significantly （P<0.001）， while mRNA expression of SPRY4 was decreased significantly （P<0.001）. CONCLUSIONS： MEF2D can promote the generation and development of drug resistance of hepatoma carcinoma cells to sorafenib by inhibiting expression of SPRY4 and active of RAS/ERK pathway.

KEYWORDS Sorafenib； Hepatoma carcinoma cells； Resistant mechanism； MEF2D

肝癌是我国最常见的肿瘤之一，据统计，我国新增肝癌患者的病例数和死亡人数居全世界首位[1]。随着医学技术的发展，肝癌治疗的方式和方法有了大幅度的改善，但现有的治疗手段仍无法显著提高肝癌患者的生存率。肝癌易复发、易转移、预后差等问题仍然困扰着医务工作者和科研工作者[1]。

目前，RAS/细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂索拉菲尼在治疗肝癌上取得了一定的疗效，是肝癌晚期系统性治疗的唯一选择[2]。RAS/ERK信号通路是肝癌的关键驱动因子，也是索拉菲尼的重要治疗靶点[3]。RAS/ERK信号通路由一系列可以发生级联激活的蛋白激酶组成，如RAS、有丝分裂原激活的蛋白激酶（RAF）、促分裂原活化蛋白激酶（MEK）、ERK以及通路负调控因子快速发育生长因子同源蛋白4（SPRY4）等，处于激活状态的ERK影响一系列与增殖、存活、侵袭和免疫逃避相关的转录因子的稳定性、入核能力或促转录活性，最终导致肿瘤的发生、发展、转移和复发。然而部分肝癌患者对索拉菲尼存在不同程度的耐药，使得其预后较差。相关研究表明索拉菲尼耐药可能与RAS/ERK级联激活相关[4]。作为肌细胞增强因子的成员之一，肌细胞增强因子2D（MEF2D）不仅在人体发育和生理功能中发挥重要作用[5]，而且MEF2D异常表达与包括肝癌在内的多种疾病的发生发展也关系密切[6]。研究发现，MEF2D的表达在肝癌中显著升高，不仅促进肝癌的恶化，还与肝癌患者的预后存在负相关[7]。因此，笔者思考MEF2D是否在肝癌细胞对索拉菲尼的耐药中扮演着重要角色？基于此，笔者构建了索拉菲尼耐药肝癌细胞株，从细胞水平探究MEF2D蛋白及RAS/ERK通路的激活是否在肝癌细胞对索拉菲尼的耐药中起着关键作用；通过过表达MEF2D，从细胞水平探究MEF2D蛋白是否负向调控RAS/ERK通路的SPRY4因子，使通路中ERK、MEK磷酸化增加促进肝癌细胞对索拉菲尼的耐药。

1 材料

1.1 仪器

3543 CO2细胞培养箱、Mmultiskan FC酶标仪、SimpliAmpTM荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）仪均购自美国赛默飞世尔科技公司；PowerPac300电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Eclipse Ts100荧光显微镜（日本尼康公司）。

1.2 药品与试剂

索拉菲尼（美国Selleck生物科技有限公司，批号：S1040，纯度：99.5%）；DMEM高糖细胞培养基（美国生命技术公司）；腺病毒载体（上海吉凯基因化学技术公司）；Trizol总RNA提取试剂（碧云天生物研究所，批号：20171105）；qRT-PCR检测试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：R6424）；CCK-8试剂盒（上海七海复泰生物科技有限公司，批号：20170106）；RIPA裂解液（北京索莱宝生物科技公司，批号：20171206）；MEF2D抗体、MEK抗体、p-MEK抗体、ERK抗体、p-ERK抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、兔二抗均购置美国Abcam公司。

1.3 细胞

人肝癌细胞PLC购自中国科学院上海细胞库。

2 方法与结果

2.1 细胞的培养

PLC细胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞进行试验。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力

将PLC以5×103个/孔分别接种于96孔培养板中培养24 h，加入终浓度为0、2、4、8、16、32 ?mol/L的索拉菲尼，培养48 h后，每孔加入10 ?L CCK-8试剂，孵育3 h后，使用酶标仪在450 nm波长下测定细胞的光密度（OD）值。OD值越大表示细胞增殖能力越强。根据公式计算细胞增殖抑制率（%）：[空白组（索拉菲尼终浓度为0 ?mol/L）OD-索拉菲尼處理组OD]/空白组OD×100%，然后通过SPSS软件计算半数抑制浓度（IC50）。

2.3 索拉菲尼耐药肝癌细胞株的构建

将对数生长期的PLC接种于含有10%胎牛血清的含药DMEM培养基（索拉菲尼终浓度为其对PLC的IC50）中，孵育72 h后，弃去含药培养基，加入新鲜的DMEM培养基，继续培养72 h后用PBS清洗3遍，再用该含药DMEM培养基培养72 h，共进行3次，构建索拉菲尼耐药肝癌细胞株（PLC-DR3）。然后用倒置显微镜观察PLC和PLC-DR3的细胞形态变化，利用“2.2”项下方法检测PLC-DR3增殖能力并计算索拉菲尼对PLC-DR3的IC50，根据公式计算耐药指数：PLC-DR3细胞IC50/PLC细胞IC50。

2.4 过表达MEF2D对PLC增殖的影响

将10 MOI（感染复数）的腺病毒载体Ad-MEF2D（过表达MEF2D载体）感染PLC（感染后细胞命名为PLC-AdMEF2D）。利用“2.2”项下方法检测PLC-AdMEF2D的增殖能力并计算索拉菲尼对其的IC50。

2.5 Western blot法检测PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D中蛋白的表达

取PLC、PLC-DR3、PLC-AdMEF2D分别按照RIPA裂解液的操作说明提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，变性后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转入聚偏二氟乙烯膜，经5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，分别置于稀释1 000倍的一抗液（MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4抗体），封口，4 ℃孵育过夜，PBS洗膜3次后，加入稀释1 000倍的兔二抗，室温孵育1 h，PBS洗膜3次后进行显影，检测灰度值。以目标蛋白与内参GAPDH灰度值的比值表示MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4的相对表达水平。

2.6 qRT-PCR法检测PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表达

取PLC、PLC-AdMEF2D按照Trizol说明书提取总RNA，逆转录为cDNA，然后根据qPCR试剂盒说明书进行扩增。MEF2D的上游引物序列为5′ -GACACAGC- ACCTCAGCAA-3′ ，下游引物序列为5′ -GGAGATCC- AAGAATACCC-3′ ，扩增长度为110 bp；SPRY4的上游引物序列为5′ -AGTGGATCCGCCACCATGGAGCCC- CCGATCCCAC-3′ ，下游引物序列5′ -CTATTACTCGA- GTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGAA- AGGCTTGTCCGGTCTG-3′ ，扩增长度为120 bp。GAPDH的上游引物序列为5′ -AAGAGAGGCATCCTGA- CCCT-3′，下游引物序列为5′ -TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′，扩增长度为20 bp。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40循环。采用 2-ΔΔct相对定量法（目的基因ct值/内参基因ct值）对SPRY4、MEF2D的mRNA表达进行相对定量。

2.7 统计学分析

采用统计软件SPSS 18.0进行处理，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 索拉菲尼对PLC增殖能力的影响

随着索拉菲尼药物浓度的增加，作用PLC 48 h的OD值逐渐减小，PLC增殖能力减弱，PLC的IC50值为（8.23±0.06） ?mol/L。索拉菲尼对PLC增殖能力的影响结果见表1。

3.2 索拉菲尼耐药肝癌细胞株的构建结果

PLC和PLC-DR3的细胞形态如图1所示，PLC-DR3细胞相比PLC细胞小，呈圆形，且有部分漂浮的死细胞。随着索拉菲尼药物浓度的增加，作用PLC-DR3细胞48 h的OD值逐渐减小，经SPSS 18.0软件计算得PLC-DR3的IC50为（21.80±0.06） ?mol/L，其耐药指数为3。索拉菲尼对PLC-DR3细胞增殖能力的影响结果见表2。

3.3 过表达MEF2D对PLC增殖能力的影响

与PLC比较，过表达MEF2D后PLC-AdMEF2D的IC50[（19.46±0.063） ?mol/L]明显增加（P<0.001），表明过表达MEF2D后PLC的增殖能力增强。过表达MEF2D对PLC增殖能力的影响见表3。

3.4 PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表达

与PLC比较，PLC-DR3中总ERK蛋白表达水平基本不变，MEF2D、p-ERK蛋白表达明显增强（P<0.001），即ERK蛋白的磷酸化增强，说明MEF2D蛋白表达增强及ERK通路的激活在PLC对索拉菲尼耐药中起着重要作用。PLC、PLC-DR3中MEF2D、p-ERK、ERK蛋白的表达电泳图见图2，测定结果见表4。

3.5 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、SPRY4蛋白的表达

与PLC比较，PLC-AdMEF2D中ERK、MEK表达量基本不变，p-ERK、p-MEK的表达增强（P<0.01），SPRY4蛋白的表达水平明显减弱（P<0.001）。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、ERK、p-ERK、MEK、p- MEK、SPRY4蛋白表达的电泳图见图3，测定结果见表5。

因此推测，过表达MEF2D后使得ERK、MEK磷酸化增加，通路活性升高，从而增加PLC对索拉菲尼的耐药性。

3.6 PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D、SPRY4 mRNA的表达

与PLC比较，PLC-AdMEF2D中SPRY4 mRNA的表达明显减弱（P<0.001），说明过表达MEF2D抑制了SPRY4 mRNA的表达。PLC、PLC-AdMEF2D中MEF2D mRNA、SPRY4 mRNA的表达结果见表6。

4 讨论

肝癌是最常见的恶性原发性肝脏肿瘤，基础医学研究逐渐揭示了肝癌发生发展的分子机制，其中特定信号通路的异常激活对肝癌的形成、生长、转移和复发至关重要。研究发现，肝癌中RAS/ERK通路的活性处于持续激活的状态[8-9]。更为重要的是，异常激活的RAS/ERK 通路促进了肝癌的发生、发展、转移和复发[10]，而且RAS/ERK通路活性强的肝癌患者往往预后较差[11]。由此可见，RAS/ERK通路是一個理想的肝癌治疗靶点。目前，RAS/ERK通路的抑制剂类药物己经应用到肝癌的治疗中，例如索拉菲尼。索拉菲尼作为多激酶抑制剂，可以通过抑制 RAF和血管内皮生长因子受体激酶，阻断下游通路的激活达到抑制肝癌的作用，并且在其他实体瘤中也有临床效果[12]。在两项晚期肝癌患者的随机Ⅲ期临床试验中，索拉非尼治疗组的病人相对安慰剂组疾病进展时间延长2.8个月，同时总生存期延长2.3个月[2]。现有的临床结果显示，索拉菲尼对肝癌的治疗效果表现出较大的差异。部分患者应答程度较高，存活时间显著延长，而部分患者则表现出对索拉菲尼的耐药，预后未得到改善[13]。索拉菲尼耐药性的产生限制了其治疗价值，一方面，肝癌患者对索拉菲尼敏感性存在差异的原因尚不清楚，另一方面，缺乏预测肝癌治疗预后的分子标记物[14]。因此，迫切需要研究肝癌对索拉菲尼发生耐药的分子机制。这不仅有助于肿瘤靶向治疗方案的制定，也有助于指导肿瘤耐药对策的制定，从而避免不必要的经济负担和毒副作用。

本研究发现，通过在肝癌细胞株中上调MEF2D表达，可从细胞水平确定过表达MEF2D可促进肝癌细胞对索拉菲尼耐药。其次，通过分子和细胞生物学技术确定MEF2D可通过抑制SPRY4表达继而影响其下游RAS/ERK通路的活性，最终影响肝癌细胞对索拉菲尼的耐药性。本研究结果为阐明MEF2D影响肝癌对索拉菲尼的耐药机制中的作用提供试验依据，也为预测肝癌患者采用索拉菲尼治疗的效果提供可能的分子标记物。

参考文献

[ 1 ] YU G，JING Y，KOU X，et al. Hepatic stellate cells secreted hepatocyte growth factor contributes to the chemoresistance of hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One，2013，8（9）：73312-73321.

[ 2 ] LIU L，CAO Y，CHEN C，et al. Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J]. Cancer Res，2006，66（24）：11851- 11858.

[ 3 ] CALVISI DF，LADU S，CONNER EA，et al. Inactivation of Ras GTPase-activating proteins promotes unrestrained activity of wild-type Ras in human liver cancer[J]. J Hepatology，2011，54（2）：311-319.

[ 4 ] GALMICHE A，CHAUFFERT B，BARBARE JC. New biological perspectives for the improvement of the efficacy of sorafenib in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett，2014，346（2）：159-162.

[ 5 ] POTTHOFF MJ， OLSON EN. MEF2： a central regulator of diverse developmental programs[J]. Development，2007，134（23）：4131-4140.

[ 6 ] PON JR，MARRA MA. MEF2 transcription factors： developmental regulators and emerging cancer genes[J]. Oncotarget，2016，7（3）：2297-2312.

[ 7 ] MA L，LIU J，LIU L，et al. Overexpression of the transcription factor MEF2D in hepatocellular carcinoma sustains malignant character by suppressing G2-M transition genes[J]. Cancer Res，2014，74（5）：1452-1462.

[ 8 ] YOSHIDA T，HISAMOTO T，AKIBA J，et al. Spreds，inhibitors of the Ras/ERK signal transduction，are dysregulated in human hepatocellular carcinoma and linked to the malignant phenotype of tumors[J]. Oncogene，2006，25（45）：6056-6066.

[ 9 ] NEWELL P，TOFFANIN S，VILLANUEVA A，et al. Ras pathway activation in hepatocellular carcinoma and anti-tumoral effect of combined sorafenib and rapamycin in vivo[J]. J Hepatology，2009，51（4）：638-639.

[10] SHILO A， BEN HV， DENICHENKO P， et al. Splicing factor hnRNP A2 activates the RAS-MAPK-ERK pathway by controlling A-RAF splicing in hepatocellular carcinoma development[J]. RNA，2014，20（4）：505-515.

[11] CALVISI DF. Accomplices in crime： The diabolical liaison between protein tyrosine phosphatase 1B and ras in hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatology，2016，63（5）： 1418-1420.

[12] BERASAIN C. Hepatocellular carcinoma and sorafenib： too many resistance mechanisms？ [J]. Gut，2013，62（12）： 1674-1675.

[13] KUCZYNSKI EA，LEE CR，MAN S，et al. Effects of sorafenib dose on acquired reversible resistance and toxicity in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Res，2015，75（12）：2510-2519.

[14] NISHIDA N，KITANO M，SAKURAI T，et al. Molecular mechanism and prediction of sorafenib chemoresistance in human hepatocellular carcinoma[J]. Dig Dis，2015，33（6）：771-779.

（收稿日期：2018-01-14 修回日期：2018-06-25）

（編辑：唐晓莲）