蒙药复方述达格—4特征图谱初步分析

杜银飞 嵇增云 信莎莎 董玉

摘 要 目的：分析蒙药复方述达格-4的特征图谱。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为 Agilent Extend C18，流动相为0.4%乙酸溶液-甲醇（梯度洗脱），流速为0.6 mL/min，检测波长为286 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。分别对复方述达格-4全方及各单味药体内外特征图谱进行分析和对比。结果：复方述达格-4全方体外特征图谱有47个峰；其体内特征图谱有24个峰，其中峰1、4、7～9、12、14、18～20、22、25、38～41、44、46对应的18个成分为体外直接入血成分；各单味药体内特征图谱中峰1、4、7、8、12、14、18～22、25、40、46来源于高良姜药材；峰14、18、19、22、44来源于木香药材；峰1、4、7～9、12、14、18、19、22来源于石菖蒲药材。结论：直接入血成分及代谢产物可能为复方述达格-4在体内发挥作用的有效成分；该方法可用于其特征图谱的分析。

关键词 蒙藥；复方述达格-4；特征图谱；化学成分；体内；体外

中图分类号 R284.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）22-3110-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.22.19

ABSTRACT OBJECTIVE： To analyse characteristic chromatograms of Mongolian Compound Shudage-4. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent Extend C18 with mobile phase consisted of 0.4% acetic acid solution-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.6 mL/min. The detection wavelength was set at 286 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. The in vivo and in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4 and single ingredients were analysed and compared respectively. RESULTS： Totally 47 peaks were identified from in vitro characteristic chromatograms of allsquare of Compound Shudage-4. There were 24 common peaks from in vivo characteristic chromatograms，among which 18 ingredients corresponding to common peaks 1， 4， 7-9， 12， 14， 18-20， 22， 25， 38-41， 44， 46 were direct blood components in vitro； peaks 1， 4， 7， 8， 12， 14， 18-22， 25， 40 and 46 of serum test sample were from Alpinia officinarum； peaks 14， 18， 19， 22， 44 were from Aucklandia lappa； peaks 1， 4， 7-9， 12， 14， 18， 19， 22 were from Acorus tatarinowii. CONCLUSIONS： Blood components and some metabolites may beallsquare of Compound Shudage-4. The method can be used for the analysis of characteristic chromatograons of it.

KEYWORDS Mongolian medicine； Compound Shudage-4； Characteristic chromatogram； Chemical component； in vivo； in vitro

复方是蒙医临床用药的主要形式，具有组方复杂多样的特点。阐明药效物质基础，找到适用于复杂体系的分析方法，一直是蒙药及其复方研究的关键问题[1]。除肠道用药和外用药等少数药物外，多数药物的药效物质均以血液为递质运送至作用靶点，产生相应的药理作用[2]。因此，通过分析含药血清，对血中移行成分进行检测，以确定蒙药复方中的直接作用物质，是其药效物质基础研究的有效途径之一[3]。

复方述达格-4又名菖蒲四味，由高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲4味药材按质量比4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1组合而成，临床多用于膈肌痉挛、胸闷气短、胸肋刺痛、消化不良等症的治疗，是蒙医常用的消喘止痛传统配方。《国家卫生部药品标准·蒙药分册》[4]仅涉及复方述达格-4各味药材的鉴别与含量测定，并未收载此复方。本课题组前期对复方述达格-4的化学成分、质量控制、药理作用方面进行了大量研究[5-9]，但对其特征图谱涉及较少。因此，本试验采用高效液相色谱法（HPLC）对复方述达格-4特征图谱初步分析，为其后续药动学研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪，包括DEACB06007梯度泵、DEAAC21236自动进样器、DEAAX04861检测器、JPAAJ82372柱温箱、DEACN22944化学工作站（美国Agilent公司）；BT25S型十万分之一电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S型电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）；Vortex-GENIE型微型旋涡混合仪（美国Scientific Industries公司）；3-18K型低温高速离心机（美国Sigma公司）；移液器（德国Eppendorf公司，规格：0.5～10、10～100、20～200 μL）；BCD-272型冰箱（博西华家用电器有限公司）。

1.2 试剂

山柰酚对照品（批号：20160328，纯度：99.8%）、山柰素对照品（批号：20160812，纯度：99.8%）、高良姜素-3-甲醚对照品（批号：20170919，纯度：99.8%）均购自北京坛墨质检科技有限公司；芦丁对照品（批号：100080-201209，纯度：99.4%）、茴香酸对照品（批号：100097-199402，纯度：99.8%）、槲皮素对照品（批号：100081-200406，纯度：99.8%）、丁香酚对照品（批号：110725-201414，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院； 1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮对照品、高良姜素对照品（内蒙古医科大学药学院生药学实验室自制，经氢谱、碳谱鉴定结构，经HPLC法检测以峰面积归一化法计算纯度均大于95%）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 药材

高良姜（批号：150201）、紫硇砂（批号：170701）、木香（批号：170601）、石菖蒲（批号：171001144）药材均购自内蒙古天立药业有限公司，经内蒙古医科大学药学院李骁副教授鉴定为真品。

1.4 动物

清洁级健康Wistar大鼠36只，雄性，约2月龄，体质量250～300 g，由内蒙古医科大学实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK（蒙）2015-0001；动物使用许可证号：SYXK（蒙）2015-0001]。标准条件饲养，自由进食、饮水，适宜温度、湿度，人工黑暗和光照交替。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.4%乙酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：0.6 mL/min；检测波长：286 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液和血清的制备

2.2.1 对照品溶液 分别称取高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、芦丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮對照品各适量，分别加甲醇溶解，制成单一对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取复方述达格-4方中高良姜、紫硇砂、木香、石菖蒲药材（4 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 1，m/m/m/m）共约20 kg，乙醇回流提取2次，合并提取液（回收溶剂），超声（功率：250 W，频率：40 kHz）处理5 min，经大孔树脂柱洗脱，洗脱液浓缩干燥得粉末（全方）；各单味药按全方比例分别同法制成粉末，分别加甲醇溶解，4 ℃贮藏，备用。

2.2.3 空白血清和含药血清 36只大鼠随机分成空白对照组（等体积水）、复方述达格-4（全方）组（6.3 g/kg）、 高良姜组（6.3 g/kg）、紫硇砂组（6.3 g/kg）、木香组（6.3 g/kg）、石菖蒲组（6.3 g/kg）[8]，每组6只。各给药组大鼠灌胃相应药物，空白对照组大鼠灌胃等体积水1次。大鼠给药120 min后，乙醚吸入麻醉，腹主动脉采血适量，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，即得空白血清和各含药血清，置于-20 ℃冰箱中贮藏，备用。

2.2.4 供试血清 分别取“2.2.3”项下空白血清和各含药血清0.5 mL，分别置于10 mL离心管中，加入2 mL乙腈，涡旋1 min，以3 000 r/min离心10 min，取上清液，氮气吹干，精密加入0.15 mL水使沉淀充分溶解，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2.1”项下单一对照品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果，理论板数以高良姜素、山柰酚、山柰素、高良姜素-3-甲醚、芦丁、茴香酸、槲皮素、丁香酚、1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮峰计均不低于3 000；基线分离良好，分离度均大于1.5。

2.4 复方述达格-4全方及各单味药体外特征图谱分析

取“2.2.2”项下供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，复方述达格-4全方体外特征图谱显示有47个峰，其中，峰1～8、12、15～18、20、23～30、35、38～43、46来源于高良姜药材；峰2～4、6～11、13、15、16、18、19、22、24来源于木香药材；峰1～3、5、11～16、18、19、23、24、28、29、32、33、36、39、41～44来源于石菖蒲药材。经与对照品色谱图比对，确定峰10对应成分为芦丁，峰11对应成分为茴香酸，峰20对应成分为槲皮素，峰22对应成分为丁香酚，峰24对应成分为山柰酚，峰29对应成分为1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮，峰38对应成分为高良姜素，峰39对应成分为山柰素，峰40对应成分为高良姜素-3-甲醚。

2.5 复方述达格-4全方体内特征图谱分析

取“2.2.4”项下复方述达格-4全方供试血清和空白供试血清各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图2。由图2可知，复方述达格-4全方体内特征图谱与图1A比对，峰1、4、7～9、12、14、18～20、22、25、38～41、44、46对应的18个成分为共同存在的成分（即体外直接入血成分），其他成分在图1A中未找到对应峰，推测为代谢产物；峰14、19、20、22、44对应的成分在血中相对含量增高（峰面积增大），而峰38～41对应的成分入血后其相对含量降低（峰面积减小）。

2.6 复方述达格-4各单味药体内特征图谱分析

取“2.2.4”项下各单味药供试血清和空白供试血清各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，详见图3。经图3与图2A对比可知，峰1、4、7、8、12、14、18～22、25、40、46来源于高良姜药材；峰14、18、19、22、44来源于木香药材；峰1、4、7～9、12、14、18、19、22来源于石菖蒲药材。经与对照品色谱图比对，确定峰20对应成分为槲皮素，峰22对应成分为丁香酚，峰24对应成分为山柰酚，峰38对应成分为高良姜素，峰39对应成分为山柰素，峰40对应成分为高良姜素-3-甲醚。

3 讨论

一般认为，生物样品中内源性杂质较多，所含成分复杂，且相关成分含量较低，为了凸显待测成分、保护色谱柱，需对生物样品进行前处理。常用的处理方法包括有机溶剂沉淀蛋白法、强酸沉淀蛋白法、重金属盐沉淀蛋白法、液液萃取法等[10]。预试验中，笔者分别考察了以乙腈或甲醇或L-抗坏血酸+乙酸乙酯处理血清的效果。结果发现，采用乙腈处理血清样品后可得较全的色谱峰，因此确定以乙腈与血清按体积比4 ∶ 1进行处理，去除蛋白质。

预试验中，笔者采用腹主动脉采血，分别考察了大鼠灌胃给药30、60、90、120、150、180 min后血清样品的HPLC图。经比较发现，大鼠灌胃给药120 min后血清样品的HPLC图色谱峰数目较多，因此确定120 min为最终采血时间点。

经复方述达格-4全方体内外特征图谱比对，发现有24个血中移行成分，其中有18个成分为体外直接入血成分，另外6个成分推测为代谢产物。其中，高良姜素、山柰素与高良姜素-3-甲醚在体外特征图谱中相对峰面积较大，但三者在体内特征图谱中相对峰面积明显减小。经分析，可能是由于高良姜素、山柰素与高良姜素-3-甲醚在体内未被充分游离或者是代谢为其他产物。本试验未检测到紫硇砂药材体内外特征图谱，是否由于色谱条件不适宜所致仍有待进一步分析。基于此，本课题组后续将对复方述达格-4全方及各单味药体内外特征图谱中相对面积较小的峰进行指认，并对有关成分体内代谢产物进行追踪，从而对复方述达格-4进行较为全面的分析。

参考文献

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[ 6 ] 信莎莎，杜银飞，贾鑫，等. 蒙药复方述达格-4化学成分的分离与结构鉴定[J]. 北京中医药大学学报，2016，39（11）：945-948.

[ 7 ] 信莎莎，杨洋，白埔，等. 蒙药述达格-4抗小鼠胃溃疡的作用研究[J]. 北京中医药大学学报，2015，38（8）：524- 528.

[ 8 ] 贾鑫，信莎莎，杨洋，等. 蒙药复方述达格-4抗实验性胃溃疡的作用研究[J]. 内蒙古医科大学学报，2013，35（5）：381-384.

[ 9 ] 信莎莎，杨洋，孙国园，等. HPLC法测定蒙药复方述达格-4中1-苯基-7-（3-甲氧基-4-羟基）苯基-5-醇-3-庚酮的含量[J]. 内蒙古大学学報（自然科学版），2015，46（2）：191-195.

[10] 雷露静. 蒙药三子散质量控制及血清药物化学初步研究[D]. 呼和浩特：内蒙古医科大学，2016.

（收稿日期：2018-02-25 修回日期：2018-04-06）

（编辑：张 静）